Vendredi 30 novembre 2007 ADN et chromosomes Le nucléosome

Plan I - Structure et fonction de l'ADN II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne organisation des gènes le long de la molécule d'ADN III - Structure globale des chromosomes emballage de la molécule d'ADN dans les chromosomes

II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne 1 - Le chromosome 2 - Organisation des gènes sur le chromosome 3 - Cycle du chromosome 4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre 5 - Emballage de l'ADN 6 - Régulation de l’activité de la chromatine

1 - Le chromosome L'ADN est divisé en chromosomes Génome = 3,2 milliards de paires de nucléotides 24 chromosomes différents 1 chromosome = 1 molécule d'ADN + protéines ADN + protéines = chromatine

Chromatine (Walter Flemming 1882) ADN + protéines Décrit par Flemming (1882) Colorable

Walter Flemming (1843-1905) Cytologiste allemand connu pour avoir décrit le premier la division cellulaire appelée mitose. Également le premier à décrire les chromosomes. Études de médecine et de zoologie jusqu’en 1868 dans plusieurs universités allemandes. Thèse sur les muscles ciliaires Assistant, puis professeur S'installe définitivement à Kiel comme professeur d'anatomie et directeur de l'institut d'anatomie, jusqu'à sa retraite en 1901.

Walter Flemming (1843-1905) Vers le milieu du XIXe siècle, la connaissance de la division cellulaire était limitée par la faible qualité des lentilles des microscopes et des méthodes de coloration. Certains scientifiques pensaient qu'il s'agissait d'une division directe, mais d'autres postulaient l'existence de phases intermédiaires pendant lesquelles le noyau « père » se dissociait avant de reconstituer deux noyaux fils. Walter Flemming est le premier à décrire, dans son ouvrage Zellsubstanz, Kern, Zelltheilung, publié en 1882, les différentes phases de la division cellulaire.

Walter Flemming : Les différentes phases de la division cellulaire A cette occasion, il forge les mots mitose, chromatine, plan équatorial et achromatine. Il est également un des premiers cytologistes à décrire les chromosomes pendant la division cellulaire, sans pour autant expliquer leur rôle Il remarque la constance de leur nombre pour une espèce donnée.

Walter Flemming : autres travaux Amélioration de certains fixateurs et colorants cellulaires Description de l'amitose, division cellulaire directe par étranglement du corps cellulaire et du noyau, phénomène qu'il considère toutefois, de façon erronée, comme pathologique.

Protéines de la chromatine Emballage de l'ADN Régulation de l'expression des gènes Réplication et réparation de l'ADN

Chromosome bactérien Une seule molécule d'ADN circulaire Protéines d'emballage différentes Mal connu

Les chromosomes eucaryotes Chaque cellule a deux copies de chaque chromosome une héritée du père et une héritée de la mère Chromosomes homologues Exception : chromosomes sexuels chez le mâle Y hérité du père X hérité de la mère

Jeux chromosomiques Homme : 22 paires d'autosomes + X + Y Femme : 22 paires d'autosomes + X + X Homme : 46,XY Femmes : 46,XX

Mise en évidence des chromosomes Hybridation Colorants

Fig 4-10 Hybridation de chromosomes humains masculins Caryotype spectral (peinture chromosomique) Fig 4-10

Fig 4-11 Chromosomes humains masculins Coloration au Giemsa chaque chromosome a un marquage longitudinal spécifique qui permet de le reconnaître Fig 4-11

Caryotype Affichage des 46 chromosomes à la mitose Mise en évidence des anomalies

Caryotype féminin normal

Fig 4-12 Anomalie chromosomique 4 12 4 12 N t N t (A) Coloration au Giemsa (B) Peinture chromosomique 4 12 4 12 Fig 4-12 N t N t

2 - Organisation des gènes sur le chromosome Un gène  protéine ARN

Complexité d'un organisme  nombre de gènes Corrélation positive Bactérie : 500 Humain : 30 000 Beaucoup d'ADN sans information dépotoir (!) expression des gènes

Génomes ayant été totalement séquencés (A) Eubactéries Table I-1

Génomes ayant été totalement séquencés (B) Archae Table I-1

Génomes ayant été totalement séquencés (C) Eucaryotes Table I-1

Fig 4-13 Génome de Saccharomyces cerevisae 16 chromosomes Couleurs fonctions du pays qui a séquencé 12 147 813 nucléotides 6000 gènes Fig 4-13

Complexité d'un organisme  génome ( ADN) Corrélation non systématique Génome humain = 200 X génome de Saccharomyces cerevisae Certaines plantes ou amphibiens = 30 X génome humain Amibe = 200 X humain Certains organismes proches les uns des autres = 100 X en raison de l'ADN en excès (même nombre de gènes)

Variation du nombre de chromosomes Homme : 46 Certains cervidés : 6 Certaines carpes : >100 Espèces très proches de Muntjac Pas de relations simple entre nombre de chromosomes complexité de l'espèce taille du génome

Fusion de chromosomes Fig 4-14

Analyse du séquençage du génome 1999 Séquençage du chromosome 22 (le plus petit)

1,5% du génome Fig 4-15

Analyse du séquençage du génome Science et Nature février 2001 Human Genome Project (2001)

Données statistiques du chromosome 22 et de tout le génome humain Table 4-1

Génome humain 25 fois plus gros que tous les génomes séquencés précédemment 8 fois la somme de tous les génomes séquencés précédemment Séquençage à 1000 nucléotides par seconde A fait reconsidérer toute la biologie 4ème édition du livre entièrement revue

Fig 4-16 Échelle du génome (A) si 1 mm entre deux bases… (B) génome = 3 200 km un gène codant pour une protéine tous les 300 mètres un gène  30 mètres Fig 4-16

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 1 - Quelques % codent pour des protéines ou de l'ARN de structure ou catalytique Le reste = petits morceaux d'ADN mobiles qui se sont incorporés dans le chromosome au cours de l'évolution

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 2 - Taille moyenne d'un gène élevée une protéine moyenne = 430 acides aminés  1 300 paires de nucléotides or un gène moyen = 27 000 paires de nucléotides beaucoup d'ADN non codant qui s'intercale dans l'ADN codant : introns / exons Alternance exons / introns dans les gènes Pas d'introns dans les organismes à génome compact  moins d'ADN Séquences régulatrices d'ADN des dizaines de milliers de paires de nucléotides

Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain LINES, SINES, retro-viral like elements, DNA only transposons : éléments génétiques mobiles qui se sont multipliés et insérés en différents endroits du génome Fig 4-17

Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain Segmental duplications : gros blocks (1 000 à 200 000 nucléotides) présents à 2 ou plus endroits du génome Simple sequence repeats (< 14 nucléotides) répétés encore et encore Fig 4-17

Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain Plus de la moitié des séquences uniques sont des gènes Le reste probablement des séquences régulatrices Fig 4-17

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 3 - Grand désordre dans l'information grande pagaille, fouillis, désordre beaucoup d'ADN dépotoir information importante répartie dans tout ce désordre on n'a jamais rien éliminé

Problèmes posés par l'étude des gènes La plupart de l'ADN est probablement sans importance Un exon  145 nucléotides en moyenne (petit) Exon flotte dans une mer d'ADN inutile Nombreux réarrangements

Solutions pour l'étude des gènes Basées sur l'observation : les séquences qui ont une fonction sont conservées pendant l'évolution Comparaison homme / souris : l'homme et la souris ont divergé d'un ancêtre commun il y a 100 millions d'années Les régions semblables sont celles dans lesquelles les mutations ont éliminé l'animal porteur par sélection naturelle : ce sont les régions conservées ( non conservées) Les expériences de la nature permettent de mettre en lumière les régions les plus intéressantes du génome

Conservation de la synténie (ordre de gènes) entre l'homme et la souris Fig 4-18(AB)

Histoire de notre chromosome 3 par comparaison avec celui d'autres mammifères Un changement tous les 5 à 10 millions d'années Fig 4-19

Vendredi 30 novembre 2007 Muller,S2000p206PNAS (fig1)

Muller,S2000p206PNAS (fig2)

Muller,S2000p206PNAS (fig3)

Muller,S2000p206PNAS (fig4)

Muller,S2000p206PNAS (fig5)

3 - Cycle du chromosome Cycle cellulaire Interphase : réplication  chromosome interphasique Mitose : condensation et séparation  chromosomes mitotiques : bien visibles

Fig 4-20 Cycle cellulaire Interphase Phase M synthèse protéique réplication de l'ADN et duplication des chromosomes Phase M Mitose Division cellulaire Fig 4-20

Fig 4-21 Chromosome interphasique Chromosome métaphasique

4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre Origines de réplication séquence d'ADN spécialisée kinétochore jusqu'à 100 000 paires de nucléotides chez l'homme Télomères 2 par chromosome Centromère

les trois séquences d'ADN nécessaires pour le maintien d'un chromosome Fig 4-22

5 - Emballage de l'ADN L'ADN est compacté en chromosomes eg : chromosome 22 = 48 millions paires de nucléotides ADN étiré = 1,5 cm interphase  plus court métaphase = 2 m  compaction = 10 000 Protéines de compaction En interphase compaction = 1 000

Aspect dynamique du chromosome En fonction du cycle cellulaire En fonction de l'activité du chromosome accès aux séquences spécifiques expression des gènes réplication de l'ADN

a) La fibre nucléosomale Chromatine ADN (50 %) Protéines (50 %) histones (60 millions de molécules de chaque classe par cellule) protéines chromosomiques non histones Nucléosome

Fig 4-23 Nucléosomes en microscopie électronique Fibre de 30 nm Après traitement : collier de perles Cordon = ADN, perle = cœur nucléosomal

b) Noyau nucléosomal De l'ADN (146 pn)... enroulé autour d'un noyau protéique formé de 8 histones 2 X (H2A, H2B, H3, H4) Premier niveau d'emballage de l'ADN (compacte l'ADN de 1/3)

Fawcett

Fawcett

Cook

Digestion de la chromatine par les nucléases qui coupent l'ADN entre les nucléosomes cf. Cook Cook200?p?

Digestion faible : l'ADN exposé entre les noyaux nucléosomaux (= ADN de liaison) (linker DNA) est dégradé Cook,P2001p?

Fig 4-24haut Noyau nucléosomal = 146 paires de nucléotides+ octamère d'histones

Cœur protéique = octamère d'histones Fig 4-24bas

ADN de liaison (linker DNA) Variable, de quelques paires de nucléotides à 80 paires de nucléotides environ en théorie, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal + 1 ADN de liaison adjacent en pratique, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal En gros, il y a un nucléosome tous les 200 paires de nucléotides

Dans une cellule 6,4 milliards paires de nucléotides  200  30 millions de nucléosomes

Structure du noyau nucléosomal Résolu en 1997 1,65 tours d'ADN autour de l'octamère d'histones

Noyau nucléosomal (diffraction des rayons X) Fig 4-25

c) Histones 1 histone  102 ~ 135 acides aminés Structure commune : 3 hélices  reliées par 2 boucles

Fig 4-26 Organisation structurale des histones du cœur protéique Motif des 4 histones Dimère H2A-H2B en "poignée de main" Fig 4-26

Formation du noyau protéique Formation d'un dimère H3 - H4 Formation d'un dimère H2A - H2B (Dimère H3 - H4) + (Dimère H3 - H4) = (Tétramère H3 - H4) Tétramère H3 - H4 + 2 (Dimère H2A - H2B) = noyau protéique

Assemblage d'un octamère d'histone Fig 4-27haut

Fig 4-27bas Assemblage d'un octamère d'histone Les 8 extrémités -N font saillie Dimère H3 - H4 Dimère H2A - H2B Fig 4-27bas

Interface ADN / histones 142 liaisons H entre ADN et histones Histones riches en lys et arg (+) ADN chargé (-) Longue queue N terminal  modifications covalentes

Conservation des histones Vendredi 30 novembre 2007 Conservation des histones Parmi les plus conservées des protéines des eucaryotes H4 petit pois et H4 de la vache ne diffèrent que à 2 positions sur 104 Il existe des variants #9p211

d) Position des nucléosomes sur l'ADN Vendredi 30 novembre 2007 d) Position des nucléosomes sur l'ADN Flexibilité de l'ADN Liaison d'autres protéines #10p211

Vendredi 30 novembre 2007 Flexibilité de l'ADN Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe) Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours  compression du sillon mineur AT est plus facile à courber que GC #10p211

Fig 4-28 #10p211 Compression du petit sillon autour du nucléosome Vendredi 30 novembre 2007 Fig 4-28 #10p211

Vendredi 30 novembre 2007 Flexibilité de l'ADN Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe) Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours  compression du sillon mineur AT est plus facile à courber que GC Certains nucléosomes ont une position très précise En général position approximative #10p211

Liaison d'autres protéines Vendredi 30 novembre 2007 Liaison d'autres protéines Favorise la liaison du nucléosome Obstacle à la liaison du nucléosome En fait tout est très dynamique #10p211

e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur Vendredi 30 novembre 2007 e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur "Collier de perles" = rare dans la cellule vivante Fibre de 30 nm beaucoup plus probable #11p211

Nombreux schémas de fibres de 30 nm Vendredi 30 novembre 2007 Nombreux schémas de fibres de 30 nm Zigzag… et ses variations : "mosaïque fluide de variations sur le modèle zigzag" Éléments qui interviennent l'ADN de liaison protéines de liaison à l'ADN séquence de l'ADN #11p211

Vendredi 30 novembre 2007 Bednar,J1998(fig1) Bednar,J1998(fig1)

Vendredi 30 novembre 2007 Bednar,J1998(fig2) Bednar,J1998(fig1)

Vendredi 30 novembre 2007 Bednar,J1998(fig3) Bednar,J1998(fig1)

Fig 4-29 Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag Vendredi 30 novembre 2007 Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag Fig 4-29 #11p211 Interconversion des modèles les uns dans les autres

Fig 4-30 Irrégularités de la fibre de 30 nm régions avec des protéines de liaison à l'ADN ADN sans nucléosomes Fig 4-30

Formation de la fibre de 30 nm Vendredi 30 novembre 2007 Formation de la fibre de 30 nm Histone H1 Queues des histones #11p212

Histone H1 Mal conservée Liaison avec l'ADN et les protéines Grande importance du point de sortie de l'ADN hors du nucléosome

Rôle de H1 sur le nucléosome Fig 4-31

Queues des histones Liaisons des nucléosomes les uns aux autres

Vendredi 30 novembre 2007 Rôle hypothétique des queues d'histones dans la formation de la fibre de 30 nm les queues aident à la formation de la fibre de 30 nm contact entre les queues et le nucléosome adjacent en diffraction de rayons X liaison entre queue et ADN Fig 4-32 #11p212

6 - Régulation de l’activité de la chromatine a) Les complexes de remodelage de la chromatine b) Modifications des queues des histones

a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien Vendredi 30 novembre 2007 a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien Machines protéiques qui hydrolysent de l'ATP pour changer temporairement la structure des nucléosomes et l'ADN est lié moins fort au noyau protéique du nucléosome Mouvements de H2A H2B dans le noyau protéique #12p212

Conséquences du remodelage des nucléosomes Vendredi 30 novembre 2007 Conséquences du remodelage des nucléosomes Accès de protéines aux nucléosomes expression des gènes, réplication, réparation de l'ADN Le nucléosome peut rester dans un état remodelé même après la dissociation du complexes de remodelage chromatinien mais liaisons ADN-protéines relâchées Possibilité de changement de la position des nucléosomes le long de l'ADN #12p213

Vendredi 30 novembre 2007 Modèle de mécanisme de certains complexes de remodelage chromatinien Les contacts ADN - histones sont faibles Fig 4-33 #12p213

SWI-SNF-B chromatin-remodeling complex A member of the SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin-remodeling complexes ; A multi-subunit complex that contains BRG1, BAF170, BAF155, BAF60a, BAF57, BAF53, actin, hSNF5/INI1, and BAF18

Abréviations BAF Brg1/Brm-associated factor; BAP Brm-associated protein; ChIP chromatin immunoprecipitation; HDAC histone deacetylase; HMG high mobility group; MNase micrococcal nuclease; RSC remodels the structure of chromatin; SAGA Spt–Ada–Gcn5–acetyltransferase; SWI/SNF mating type switching/sucrose non-fermenting; TBP TATA-binding protein

Chromatin consists of DNA wrapped around nucleosomes in progressively higher-order structures. Histone acetyltransferases (HATs) are an example of complexes that covalently modify DNA and lead to relaxation of chromatin structure. SWI/SNF uses ATP hydrolysis to slide nucleosomes along the DNA helix and expose the DNA to transcription factors. Often, these two types of complex work in concert to regulate transcription. Nature Reviews Cancer 4, 133-142 (2004) THE SWI/SNF COMPLEX — CHROMATIN AND CANCER Charles W. M. Roberts & Stuart H. Orkin

Kingston,RE1999p2339(fig1) Kingston,RE1999p2339(fig1) Vendredi 30 novembre 2007 Kingston,RE1999p2339(fig1) Kingston,RE1999p2339(fig1)

Kingston,RE1999p2339 (fig2) Kingston,RE1999p2339(fig1) Composition de différents complexes de remodelage chromatinien ATP-dépendent Vendredi 30 novembre 2007 Famille de complexes SWI/SNF en pourpre Homologues ISWI en rouge Kingston,RE1999p2339 (fig2) Kingston,RE1999p2339(fig1)

Kingston,RE1999p2339 (fig3) Kingston,RE1999p2339 (fig3) Vendredi 30 novembre 2007 Kingston,RE1999p2339 (fig3) Kingston,RE1999p2339 (fig3)

Kingston,RE1999p2339 (fig4) Kingston,RE1999p2339 (fig3) Vendredi 30 novembre 2007 Kingston,RE1999p2339 (fig3) Kingston,RE1999p2339 (fig4)

Complexes de remodelage chromatinien Vendredi 30 novembre 2007 Complexes de remodelage chromatinien Gros complexes protéiques de plus de 10 sous-unités Permettent l'accessibilité à l'ADN quand nécessaire Reformation des nucléosomes Contrôle étroit par la cellule Inactivés par phosphorylation pendant la mitose  compaction #12p213

Vendredi 30 novembre 2007 Mécanisme cyclique de perturbation et reformation des nucléosomes Fig 4-34

Travers,A1999p311(fig1) Travers,A1999p311(fig1) Vendredi 30 novembre 2007 Travers,A1999p311(fig1) Travers,A1999p311(fig1)

Travers,A1999p311(fig2) Travers,A1999p311(fig1) Vendredi 30 novembre 2007 Travers,A1999p311(fig2) Travers,A1999p311(fig1)

Travers,A1999p311(fig3) Travers,A1999p311(fig1) Vendredi 30 novembre 2007 Travers,A1999p311(fig3) Travers,A1999p311(fig1)

b) Modifications des queues d'histones Vendredi 30 novembre 2007 b) Modifications des queues d'histones Acétylation des lysines Méthylation des lysines Phosphorylation des sérines Ubiquitinylation #13p213

Fig 4-35(A) Modifications connues des 4 queues d'histones #13p214 Vendredi 30 novembre 2007 Modifications connues des 4 queues d'histones Fig 4-35(A) #13p214

Modifications des queues d'histones Avant ou après leur synthèse En général après l'assemblage en nucléosome Enzymes nucléaires HAT (Histone Acétyl Transférase) HDAC (Histone DéACétylase)

Modifications des queues d'histones Vendredi 30 novembre 2007 Modifications des queues d'histones Agit peu sur le nucléosome Agit sur la stabilité se la fibre de 30 nm : eg acétylation déstabilise la chromatine Attraction de protéines spécifiques Modifications  code d'étirement de la chromatine à la cellule #13p215

Fig 4-35(B) #13p215 Code de modifications des histones Vendredi 30 novembre 2007 Fig 4-35(B) #13p215 Code de modifications des histones

Code de modifications des histones Vendredi 30 novembre 2007 Code de modifications des histones Nombreuses combinaisons de modifications Exemple : vient d'être répliqué ne pas transcrire #13p216

Conclusion : dynamisme de la chromatine Vendredi 30 novembre 2007 Conclusion : dynamisme de la chromatine Complexes de remodelage chromatinien Modifications des queues d'histones Compaction / décompaction permanente Coopération des deux mécanismes