Bi 231: Ingénierie des Protéines cours 4
Plan Général I. Introduction et rappels. II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.
IV. Mutagenèse: techniques et applications. Mutagenèse aléatoire. Alanine scanning. Mutagenèse dirigée
41 Mutagenèse aléatoire. Objectifs : modification du phénotype, recherche de la mutation associée Moyens : irradiations (UV, RX), produits chimiques utilisation de DNApol modifiée
Agents mutagènes Irradiations modification d'une ou plusieurs bases produits chimiques : DNApol modifiée, suppression de la fonction exonucléasique pas de correction possible (exple fragment kleenow, MutaGen™ )
42 Alanine scanning. Objectifs : recherche du (des) résidu(s) responsable(s) de la fonction d'une protéine. Moyens : amplification par PCR du gène de la protéine d'intérêt avec oligonucléotides adaptés.
Principe de la PCR.
T V V L R P S R G L Y H H P A G L R H H Séquence nucléique actgtggttcttcggccatcccgaggtctatatcatcatcctgccgggcttcggcatcatca ------------cttcggccatcccgaggtgcttatcatcatcctgccgg------------------------ Séquence protéique T V V L R P S R G L Y H H P A G L R H H - - - - - - R P S R G A Y H H P A G L R H H
43 mutagenèse dirigée Objectifs : Modification ciblée d'un résidu pour étudier sa fonction dans une protéine. Moyens : amplification par PCR du gène de la protéine d'intérêt avec oligonucléotides adaptés.
T V V L R P S R G L Y H H P A G L R H H - - - - -L R P S R D L Y H H P Séquence nucléique actgtggttcttcggccatcccgaggtctatatcatcatcctgccgggcttcggcatcatca ------------cttcggccatcccgagacctatatcatcatcctgc------------------------ Séquence protéique T V V L R P S R G L Y H H P A G L R H H - - - - -L R P S R D L Y H H P