LES MÉDIATEURS LIPIDIQUES Cours de réaction inflammatoire DE L’INFLAMMATION Cours de réaction inflammatoire MCB-63801 Hiver 2007

Dû à leur nature amphipathique, les phospholipides s’assemblent spontanément pour former des bicouches fermées

Structure des phospholipides

Les phospholipases

Phospholipides Diacylglycérol (DAG) Acide Inositol phosphatidique phosphates (IPx) PLC Acide phosphatidique PLD Phospholipides Acide arachidonique Lyso-PAF PLA2 Phosphoinositol phosphates (PIPx) PI3-K

Les phospholipases A2 Famille Enzymes kDa Calcium Expression sPLA2 cPLA2 iPLA2 PAF-AH IB (pancréatique) IIA*(synoviale) IIC IID IIE IIF V X III XII IVA (cPLA2a) IVB (cPLA2) IVC (cPLA2) VIA (iPLA2) VIB (iPLA2) VIIA VIIB VIIIA VIIIB 14 15 16 55 19 85 110 60 85-88 90 45 40 30 mM µM Non Pancréas Rate Thymus Intestins Pseudogène Poumons Thymus Coeur Reins Mastocytes Macrophages Leucocytes Intestins etc Rein Coeur Foie etc Coeur Muscle Rein * Present dans les granules de sécrétion : plaquettes, neutrophiles, macrophages, mastocytes

La cascade de l’acide arachidonique PROSTAGLANDINES THROMBOXANES ACIDES EPOXY- EICOSATRIÈNOÏQUES CYCLOOXYGÉNASES CYTOCHROME P-450 COOH ACIDE ARACHIDONIQUE 12-LIPOXYGÉNASE 15-LIPOXYGÉNASE 5-LIPOXYGÉNASE 12-HETE HEPOXILINES 15-HETE LEUCOTRIÈNES

LES PROSTAGLANDINES Formées à partir de l’AA Les endoperoxides: PGG2 et PGH2 Pont oxygène entre C9 et C11 Cycle cyclopentane entre C8 et C12 Groupement hydroxyde en C15 (indispensable à l’activité biologique). Demi-vie de quelques minutes. Les Drs Sune Bergstrom et Bengt Samuelsson se sont vu octroyer le prix Nobel de médecine en 1982 pour la découverte des prostaglandines, thromboxanes et leucotriènes.

La voie de la Cyclooxygénase COOH O OH PGH2 PGE2 PGI2 TXA2 Cyclooxygénase AA PGG2 Thromboxane synthase Prostacycline

Quelques caractéristiques des prostaglandines TXA2 stabilité 30-40 sec  TXB2 Contraction de l’aorte / Agrégation des plaquettes PGF2a (série F) Contraction des muscles lisses PGE2 (série E) Relaxation des muscles lisses, vasodilatateur Augmente l’AMP-cyclique Inhibe les fonctions des leucocytes PGI2 stabilité de quelques sec  PGF1 Vasodilation / Inhibition de l’agrégation des plaquettes Inhibition des fonctions leucocytaires Augmente l’AMP-cyclique

Prostaglandines et inflammation Elles sont produites par tous les tissus et les cellules inflammatoires en réponse à un stress ou aux stimuli inflammatoires. Phagocytose de particules ou complexes immuns LPS Cytokines pro-inflammatoires IL-1 / TNF- Bradykinine, etc… Autres évidences de leur rôle dans l’inflammation : Hauts niveaux de PGE2 dans les liquides synoviaux. Présence dans les modèles animaux d’arthrite et autres maladies inflammatoires En général: Concentrations élevées dans les liquides inflammatoires.

Les cyclooxygénases (COX) COX-1 (découverte à la fin des années 80). Expression constitutive étendue (estomac, utérus, glandes séminales, macrophages, etc). Les souris KO de COX-1 sont très peu fertiles. Problème : On constate que la synthèse de PGs ne coincide pas toujours avec l’expression de la COX-1 Identification de la COX-2 (début des années 90). Surexprimée en réponse à divers stress cellulaires et stimuli inflammatoires (LPS, IL-1, TNF, bradykinine, etc.) et inhibée par les glucocorticoïdes. Le promoteur contient plusieurs sites consensus pour des facteurs de transcription (NF-kB mais aussi CEBP, NF-IL-6, AP-1,…). COX-2 : exprimée dans les cellules inflammatoires et autres cellules aux sites inflammatoires. Souris KO de COX-2 ont des problèmes rénaux.

Prostaglandine Endoperoxide Synthase (Cyclooxygénase; COX; EC 1.14.99.1) Type I (COX-1) T ype II (COX-2) •Chromosome 9 •Chromosome 1 •ARNm de 3.0 kb •ARNm de 4.5 kb •Exprimée constitutivement dans la plupart des tissus •Inductible: -cytokines (IL-1, TNF) -endotoxines -particules opsonisées •Rôle physiologique: -activité des plaquettes -protection du tractus gastrointestinal -fonctions rénales •Rôle physiologique: -fonctions rénales -reproduction -système nerveux central •Rôle pathophysiologique: -cancer -inflammation -douleur

Quatres types de médicaments utilisés pour traiter l'arthrite rhumatoïde (AR): Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (nonsteroidal anti-inflammatory drugs ou NSAIDs) Réduisent la douleur et l’oedème; les NSAIDs ne préviennent PAS les dommages aux tissus. Ex: ASA (Aspirin, Anacin, etc.), Ibuprofen (Motrin IB, Advil, etc.) 2. Agents de rémission ou de 2e ligne (disease-modifying anti-rheumatic drugs ou DMARDS) Familles de composés qui ralentissent la progression en empêchant le système immunitaire d'attaquer les tissus. Ex: sels d'or, methotrexate, sulfasalazine, hydroxychloroquine, chloroquine et azathioprine. 3. Les corticostéroïdes: produits synthétiques, analogues de la cortisone. Utilisés pour combattre l'inflammation extrême. 4. Les thérapies biologiques (biological response modifiers ou BIOLOGICS) Certains de ces agents ciblent et neutralisent le TNF. Ex: Etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade).

NSAIDs (suite) Ils constituent le traitement le plus prescrit contre la douleur et l'inflammation dûs à l'arthrite dans le monde. Toutefois, les NSAIDs peuvent causer de sérieux effets secondaires tels que des ulcères et des saignements gastrointestinaux. Dans certains cas, leur utilisation cause la mort. Il y a une vingtaine d'années, il a été démontré que les NSAIDs exercent leurs actions anti-inflammatoires en partie par l'inhibition de la COX. Le Prof. John Vane s’est vu octroyer le prix Nobel de médecine en 1982 pour cette importante découverte, de même que pour la découverte de la prostacycline (ou PGI2).

Les inhibiteurs des cyclooxygénases (COX) Les inhibiteurs de COX-1 /2 : À part l’aspirine qui est un inhibiteur irréversible, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (Naproxen, Ibuprofen et Piroxican) sont des inhibiteurs compétitifs et réversibles. Ils sont utilisés pour leurs effets anti-inflammatoires analgésiques et antipyrétiques et n’ont aucune selectivité pour l’une ou l’autre des 2 COX. Effets secondaires : Douleur gastro-intestinale Ulcères (saignements) Insuffisance rénale Hypertension

Les inhibiteurs des cyclooxygénases (COX) Développement d’inhibiteurs spécifiques. En se basant sur la structure du site catalytique (site de liaison du substrat), de nouveaux inhibiteurs spécifiques de COX-2 ont été développés. Celebrex et Vioxx sont de 100 à 1000x plus spécifiques pour COX-2 que COX-1. Ils ont un peu moins d’effets secondaires (moins de douleurs d’estomac mais toujours autant de perforation du système digestif). L’acide aminé à la position 523 est crucial pour la sélectivité des NSAIDs pour COX-1 ou COX-2 (isoleucine pour COX-1 et valine pour COX-2).

Les inhibiteurs des cyclooxygénases (COX) COX-1 sélectif Flurbiprofen Ketoprofen COX-1 relativement sélectif Fenoprofen Piroxicam Sulindac non sélectif Aspirin Ibuprofen Indomethacin Ketorolac Naprosen Oxaprosin Tenoxicam Tolmetin PGS and Other Lipid Mediators 1998;56:341-361

Inhibition de la cyclooxygénase par l’aspirine

Les inhibiteurs des cyclooxygénases (COX) relativement sélectif Diclofenac Etodolac Meloxicam Nimesulide COX-2 très sélectif Celecoxib Rofecoxib L-743, 337 NS-398 SC 58125 PGS and Other Lipid Mediators 1998;56:341-61

Cellules endothéliales Les inhibiteurs spécifiques à la COX-2 (COXIBs) comme le Vioxx peuvent favoriser la formation de thrombus, en diminuant sélectivement la génération de prostanoïdes anti-thrombotiques (PGI2) Cellules endothéliales (COX-2) Plaquettes (COX-1) NSAID (non-spécifique) X COXIB (COX-2-spécifique) X PGE2, PGI2 Vasodilatation, Anti-thrombotique TXA2 Vasoconstriction, Pro-thrombotique

Les récepteurs des prostaglandines 4 récepteurs pour PGE2 EP1, EP2, EP3(A, B, C), EP4 1 récepteur pour PGD2 1 récepteur pour PGF2a 1 récepteur pour PGI2 1 récepteur pour TXA2 TP et  Récepteurs à 7 domaines trans-membranaires couplés à diverses protéines G (Gi et Gs) Les récepteurs EP1, EP3, FP et TP augmentent le métabolisme des phosphoinositides, l’activité de la PLC et la mobilisation du Ca2+ intracellulaire. Effets cellulaires. Contraction des muscles lisses (TP  > EP > IP). Hyperalgésie (EP) Aggrégation des plaquettes (TP).

Les récepteurs des prostaglandines Les récepteurs EP2, EP4, DP et IP ont des effets suppresseurs et inhibiteurs. Inhibition des fonctions leucocytaires et plaquettaires (EP2, EP4 > IP). Relaxation des muscles lisses (IP > EP) Vasodilatation, etc. Les effets sont en partie médiés par l’AMP-cyclique.

Les récepteurs des prostaglandines

Prostaglandines et réponse inflammatoire Les prostaglandines, plus particulièrement PGE2, sont au moins en partie responsables de la fièvre et des 4 grands symptômes (signes cardinaux) de l’inflammation, soit: rougeur chaleur oedème douleur Chaleur et rougeur sont les conséquences directes de la vasodilatation des vaisseaux sanguins et de l’augmentation du flux sanguin au niveau de la peau. PGE2, l’histamine et les kinines sont de puissants vasodilatateurs. Douleur: PGE2 augmente la perception de la douleur (nociception) par les terminaisons nerveuses au site inflammatoire. L’œdème qui cause une augmentation de la pression dans le tissu inflammé est une cause directe de douleur. L’œdème ou gonflement des tissus est la conséquence d’une augmentation de perméabilité vasculaire; la vasodilatation favorise grandement l’extravasation plasmatique et l’œdème. La fièvre dépend de la synthèse de PGE2 (et possiblement PGD2) au niveau du cerveau par la COX-2; le type de récepteur EP impliqué est inconnu.

Prostaglandines et fonctions des leucocytes PGE2, PGI2 et PGD2 inhibent les fonctions des neutrophiles (et autres leucocytes) in vitro. Phospholipase D Phagocytose Locomotion Synthèse de l’anion superoxyde Synthèse des leucotriènes et autres médiateurs lipidiques Production de cytokines (TNF, IL-2, …) et synthèse de chimiokines (IL-8). Le profil d’expression des récepteurs EP varie selon le type cellulaire. Exemples : principalement EP2 chez le neutrophile et EP4 chez le lymphocyte Th1.

La cascade de l’acide arachidonique PROSTAGLANDINES THROMBOXANES ACIDES EPOXY- EICOSATRIÈNOÏQUES CYCLOOXYGÉNASES CYTOCHROME P-450 COOH ACIDE ARACHIDONIQUE 12-LIPOXYGÉNASE 15-LIPOXYGÉNASE 5-LIPOXYGÉNASE 12-HETE HEPOXILINES 15-HETE LEUCOTRIÈNES

LES LEUCOTRIÈNES 5-lipoxygénase (PMN et macrophages) Les lipoxygénases (plaquettes) 15-lipoxygénase (éosinophiles)

Les leucotriènes « leucocytes triènes » Activité biologique connue depuis les années 40 sous le nom de SRS-A ou slow-reacting substance of anaphylaxis. Les leucotriènes ont été découverts par le Drs. Pierre Borgeat Robert Murphy et Bengt Samuelsson. Le LTA4 est le précurseur de deux types de LTs, le LTB4 et les cystéinyl-leucotriènes.

Glutathion-S-Transférase) La voie de la 5-Lipoxygénase COOH ACIDE ARACHIDONIQUE 5-Lipoxygénase OOH COOH 5-HpETE 5-Lipoxygénase COOH LTC4 synthase (LTA4 Glutathion-S-Transférase) O LTA4 OH COOH LTC4 LTA4 Hydrolase S CH 2 C H H2O 5 11 CHCONHCH COOH 2 NHCOCH CH CHCOOH 2 2 LTB4 NH HO 2 OH COOH …LTD4, LTE4

La biosynthèse des leucotriènes La 5-lipoxygenase humaine (5-LO) Oxygénation de l’AA même au 5-HpETE et élimination de H2O donne le LTA4. 5-LO : enzyme de 78-kDa localisée dans le cytoplasme.  Translocation Ca2+-dépendante au noyau. 5-LO co-localise avec la FLAP. Elle possède 1 domaine SH3 qui permet une interaction avec les protéines du cytosquelette, actine et -actinine.

Métabolisme des leucotriènes. La LTA4 hydrolase : cytosolique et se retrouve dans de nombreux tissus. Les effets biologiques du LTB4 sont diminués par -oxydation en 20-OH-LTB4 par la LTB4 hydroxylase, puis en 20-aldéhyde-LTB4. Le 20-aldéhyde-LTB4 est transformé 20-COOH-LTB4, un métabolite très peu actif.

Métabolisme des leucotriènes. Métabolisme transcellulaire du LTA4 produit par les neutrophiles. Le LTA4 libéré par les neutrophiles peut être transformé en LTB4 ou LTC4 par des cellules ne possédant pas la 5-LO mais exprimant la LTA4 hydrolase et/ou la LTC4 synthase.

Métabolisme des leucotriènes. La LTC4 synthase : enzyme membranaire de 18-kDa qui conjugue le GSH au LTA4 pour produire le LTC4 dans la région périnucléaire. Le LTC4 est métabolisé en LTD4 par la -glutamyl-transpeptidase puis en LTE4 par une dipeptase. Le LTE4 est ensuite éliminé par les voies urinaires.

Cellules impliquées dans la synthèse des leucotriènes Cellules exprimant la 5-lipoxygénase (AA LTA4 LTB4/LTC4) Neutrophiles LTB4 Eosinophiles LTC4 Basophiles LTC4 Monocytes LTB4 + LTC4 Macrophages alvéolaires LTB4 Macrophages péritonéaux LTB4 + LTC4 Mastocytes LTB4 + LTC4

Cellules impliquées dans la synthèse des leucotriènes Cellules exprimant la LTA4 hydrolase ou la LTC4 synthase (LTA4 LTB4/LTC4) Érythrocytes Lymphocytes Cellules endothéliales Plaquettes

Stimuli de la synthèse des leucotriènes •Peptides formylés •Fragment du complément C5a •’Platelet-activating factor’ •Lipopolysaccharides •Particules opsonisées •Complexes immuns •AA et LTB4 •IL-8

Activation & Chimiotaxisme - Constriction des muscles lisses du Activités biologiques des leucotriènes OH COOH S CH2 HO OH C5H11 CHCONHCH2 COOH COOH NHCOCH2 CH2 CHCOOH NH2 LEUCOTRIÈNE B4 (LTB4) LEUCOTRIÈNE C4 (LTC4) Activation & Chimiotaxisme des phagocytes - Constriction des muscles lisses du tractus respiratoire - Augmente la perméabilité vasculaire Plusieurs antagonistes des récepteurs du BLT1 et du BLT2 ont été développés. In vivo ils bloquent le recrutement des leucocytes (neutrophiles) aux sites inflammatoires.

Les récepteurs des leucotriènes Récepteurs du LTB4 ou BLT BLT1: Récepteur de la famille des GPCRs hautement sélectif pour le LTB4 et présent sur les leucocytes, les tissus pulmonaires et dans la rate. LTB4 > 5-HETE, 12-HETE > di-HETE. L’analyse du promoteur du BLT1 a permis la caractérisation d’un second récepteur, le BLT2. Expression plus étendue que BLT1, mais affinité plus faible; le BLT2 est également moins spécifique que le BLT1 pour le LTB4 (5-HETE, 12-HETE  > di-HETE = LTB4).

Les récepteurs des cystéinyl-leucotriènes Le Cys-LT1: Ce récepteur possède une haute affinité pour le LTC4. Expression : Tissus des voies digestives et respiratoires, éosinophiles. Régulé par plusieurs cytokines proinflammatoires (IL-5). Le Cys-LT2: Ce récepteur est sélectif pour le LTD4 et LTE4.

La transduction du signal Quelques voies de signalisations et fonctions du neutrophile stimulées par le BLT1 Phospholipases C et D Les voies MAP kinases Stimule la chimiotaxie et phagocytose LTB4 stimule sa propre synthèse par une boucle de régulation autocrine Explosion oxydative Le BLT2 stimule les mêmes voies de signalisation.

Leucotriènes et pathologies inflammatoires Détectés dans plusieurs tissus et fluides inflammatoires. Cystéinyl-LT Liquide de lavage bronchoalvéolaire et urine de patients avec hypersensiblité bronchique Syndrome de détresse respiratoire Obstruction pulmomaire chronique Arthrite juvénile Conjonctivites et rhinites LTB4 Maladies inflammatoires de l’intestin (Crohn). Psoriasis Liquides synoviaux (Arthrite Rhumatoïde)

Leucotriènes et pathologies inflammatoires

Modèles animaux 5-LO KO L’inflammation péritonéale en réponse au glycogen ou au Zymozan est diminuée. L’inflammation cutanée induite par l’AA est réduite. Les souris 5-LO KO sont plus sensibles aux infections pulmonaires. La phagocytose de pathogènes par les monocytes-macrophages est diminuée. Les souris 5-LO KO sont plus résistantes à l’hypotension induite par le PAF. La FLAP est essentielle à l’activité de la 5-LO. Le phénotype des souris déficientes en FLAP est donc très similaire aux KO de la 5-LO.

Les interventions thérapeutiques Inhibiteurs de FLAP. Inhibiteurs de 5-LO (Zileuton). Antagonistes des récepteurs du LTB4 et des cystéinyl-leucotriènes (Singulair et Accolate).

LES ACIDES GRAS INSATURÉS OMEGA-3

Métabolisme des acides gras omega-3/omega-6 COOH OH O COOH COOH (C20:4 n-6) LTA4 PGG2 AA (LTB4, LTC4,…) (PGE2, PGI2, TXA2…) 5-Lipoxygénase Cyclooxygénase EPA (C20:5 n-3) O COOH COOH O COOH O OH O LTA5 PGG3 (LTB5, LTC5,…) (PGE3, PGI3, TXA3…)

Le facteur d’activation des plaquettes (platelet-activating factor ou PAF) Produit par plusieurs types cellulaires. Les plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales vasculaires, etc.

PAF: Rôle physiologique Agrégation des plaquette (Agrégation) Activation des leucocytes (Synthèse de leucotriènes) Modulation du système immunitaire Interactions leucocytes/endothélium vasculaire Joue un rôle dans la phase initiale de la réponse inflammatoire : Adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales.

Influx des neutrophiles aux sites inflammatoires 1. Margination/Rolling - Sélectines 2. Adhésion Ferme- Intégrines/Superfamille des Ig 3. Transmigration. 4. Chimiotaxie. 5. Phagocytose

Integrins/Ig superfamily Le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires Rolling/Activation Adhesion Transmigration Selectins Integrins/Ig superfamily WBC Activation PECAM-1, others Endothelial Activation Chemoattractants Stimulus Chemotaxis

Interaction leucocytes/endothélium vasculaire Les cellules endothéliales activées par un stimulus inflammatoire produisent le PAF. Le PAF est exposé à leur surface et lie les récepteurs du PAF sur les leucocytes qui roulent sur l’endothélium « rolling ». Transduction du signal par les récepteurs du PAF sur les leucocytes Activation et expression des intégrines Adhésion ferme à l’endothélium vasculaire Transmigation à travers les parois vasculaires et migration vers l’agent chimiotactique (site inflammatoire). L’utilisation d’antagonistes de récepteurs du PAF a permis de démontrer son implication dans les interactions cellulaires: endothélium vs leucocytes plaquettes vs neutrophiles

Platelet-activating factor provides the activation signal for leukocytes adhering to endothelium that expresses P-selectin

Biosynthèse du PAF Deux voies: Remodelage des phospholipides membranaires. 2) Biosynthèse de-novo. Dans le contexte d’une réaction inflammatoire la voie principale est le remodelage. En général le PAF n’est pas produit par les cellules; l’activation de celles-ci en déclenche la biosynthèse. Lyso-PAF PAF PAF

Etapes de la biosynthèse du PAF par la voie du remodelage Etape 1. Activation de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2a) libération d’un acide gras (AA) et d’un lyso-phospholipide (1-0-alkyl-2-lyso-PtdCho ou lyso-PAF). Note : La cPLA2 est impliquée dans cette synthèse. En effet les souris déficientes en cPLA2 sont incapables de produire du PAF. Cette voie de biosynthèse mène à une production simultanée de PAF et d’eicosanoïdes par les voies 5-LO et COX. Etape 2. Le lyso-PAF est transformé en PAF par une acétyl-transférase agissant en position 2. Il s’agit de l’étape limitante de la biosynthèse du PAF contrôlée par la phosphorylation/ déphosphorylation de l’acétyl-transferase.

Le récepteur du PAF Lie le PAF avec grande affinité. Appartient à la famille des GPCR. Les phospholipides oxidés (HDL/LDL/VLDL) et les lyso-phospholipides (lyso-alkyl-phosphatylcholine) ont une certaine affinité pour le récepteur du PAF. Cette liaison est bloquée par le PAF ou un antagoniste du récepteur. Le PAF est de 100 à 1000 fois plus efficace que le lyso-PAF pour activer le récepteur du PAF.

Le récepteur du PAF Le récepteur semble être couplé à plusieurs types de protéines G (pertussis toxine sensible et insensible) Activation des phospholipases C/D. Activation des voies MAP kinases. Inhibe la formation d’AMP-cyclique. Activation de tyrosines kinases. Synthèse de médiateurs lipidiques. Chimiotaxie. Explosion oxydative. Mécanismes de désensibilisation/internalisation du récepteur. Phosphorylation de résidus Ser/Thr en position C-terminale du récepteur par des kinases (PKA, PKC, GRK). Site de phosphorylation PKC (désensibilisation hétérologue). Site de phosphorylation des kinases des GPCRs, les GRKs. (désensibilisation homologue).

L’étude de la relation structure-fonction du récepteur du PAF a permis de déterminer les régions responsables de la liaison du ligand, de la signalisation et de la désensibilisation.

PAF et maladies inflammatoires pulmonaires Présence de PAF (bioactivité) dans les lavages alvéolaires de patients en détresse respiratoire mais pas dans les lavages alvéolaires de sujets sains. Au niveau pulmonaire: -L’accumulation et l’adhésion de plaquettes dans le réseau vasculaire du poumon en réponse à des endotoxines sont bloquées par un antagoniste du PAF. -A l’inverse l’infusion de PAF causera un dépôt massif des plaquettes aux poumons. -Participe au recrutement des neutrophiles. -Participe à l’oedème pulmonaire. -Le PAF augmente l’effets des endotoxines  hypotension systémique.

PAF: modèles animaux et conclusion Les souris transgéniques qui surexpriment le récepteur du PAF sont plus sensibles aux chocs endotoxiques. Elles sont protégées par les antagonistes du récepteur du PAF. Conclusion : La littérature suggère un rôle important du PAF dans les chocs endotoxiques et désordres inflammatoires au niveau vasculaire et pulmonaire.

LES MÉDIATEURS LIPIDIQUES Cours de réaction inflammatoire DE L’INFLAMMATION Cours de réaction inflammatoire MCB-63801 Hiver 2007