Organisation fonctionnelle des système hématopoïétique et immunitaire Bertrand Arnulf Immuno-hématologie Hôpital Saint Louis

Les éléments du sang Sang: suspension de cellules dans le plasma Plasma: Sels minéraux, glucides, lipides acides aminés Sérum: plasma dépourvu de fibrinogène après coagulation Cellules du sang: Globules blancs (leucocytes) - Polynucléaires ou granulocytes neutrophile (PN), éosinophile, basophile - Lymphocytes - Monocytes Globules rouges (érythrocytes, hématies) Plaquettes (thrombocytes)

Les éléments du sang Cellules myéloïdes Cellules lymphoïdes Plaquettes PN eosinophile PN basophile Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte/Macrophage lymphocytes Défense antibactérienne Réactions immunitaires non spécifiques Transport oxygène du poumon aux tissus Défense antibactérienne Hémostase primaire coagulation Défense antivirale Réactions immunitaires spécifiques

Les éléments du sang Examen qualitatif et quantitatif des éléments figurés du sang: L’hémogramme Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte lymphocytes 100 – 1000/mm3 Hémoglobine Homme: 13 g/dl Femme: 12g/dl 1700 – 7000/mm3 150-450 103/mm3 ou 109/L 1500 – 4000/mm3

Les éléments du sang Examen qualitatif et quantitatif des éléments figurés du sang: L’hémogramme Volume plasmatique Volume globulaire normal Anémie vraie Fausse anémie par hémodilution 1OO Globules rouges Volumes relatifs du plasma et des globules rouges: Hématocrite (homme 40-54%; femme 35-47%) Volume globulaire moyen (VGM): taille des globules rouges Hématocrite/nombre de globules rouges

Origine des éléments du sang hématopoïèse Moelle osseuse: siège de l’hématopoïèse dès la naissance Hématopoïèse: Système de différenciation et de prolifération assurant le renouvellement des cellules du sang Cellules souches: Pour assurer un renouvellement permanent des cellules myéloïdes et lymphoïdes. Propriétés des cellules souches: différenciation et autorenouvellement. Peu de prolifération Différents compartiments de cellules « souches » immatures selon leurs degré d ’engagement vers une lignée déterminée.

Origine des éléments du sang hématopoïèse Différents compartiments de cellules « souches » immatures selon leurs degré d ’engagement vers une lignée déterminée. Cellules souches Pluripotentes autorenouvellement Progeniteurs multipotents Précurseurs engagés ou déterminés Cellules sanguines matures

Hématopoïèse Cellules souches Pluripotentes Progeniteurs multipotents Moelle osseuse CSH-LT Cellules souches Pluripotentes CSH-CT Progeniteurs multipotents PCM PCL PEM PGM Précurseurs engagés ou déterminés Mégacaryoblaste Erythroblaste Promyélo/metamyélocyte Monoblaste Pré/prolymphocyte Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte/ Macrophage Lymphocyte B Lymphocyte T Cellules sanguines matures sang

Ontogenèse des lymphocytes T et différenciation B Lymphocyte T immature thymus Lymphocyte T mature Progéniteur Commun Cellules souches Organes Ganglion lymphatique Lymphocyte B naïf Moelle osseuse B mémoire plasmocyte

Hématopoïèse Cellules souches Pluripotentes Progeniteurs multipotents Moelle osseuse CSH-LT Cellules souches Pluripotentes CSH-CT Progeniteurs multipotents PCM PCL PEM PGM Précurseurs engagés ou déterminés Mégacaryoblaste Erythroblaste Promyélo/metamyélocyte Monoblaste Pré/prolymphocyte Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte/ Macrophage Lymphocyte B Lymphocyte T Cellules sanguines matures sang

Hématopoïèse Moelle osseuse Prolifération Amplification sang CSH-LT Cellules souches Pluripotentes CSH-CT Progeniteurs multipotents PCM PCL PEM PGM Prolifération Amplification Précurseurs engagés Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte/ Macrophage Lymphocyte B Lymphocyte T Cellules sanguines matures sang

Hématopoïèse 100 à 250 milliards de globules rouges par jour 70 à 150 milliards de plaquettes par jour Plusieurs dizaines de milliards de polynucléaires par jour

Facteurs de croissance hématopoïétiques Hématopoïèse Facteurs de croissance hématopoïétiques Correspondent à des « hormones » de l’hématopoïèse Facteurs agissant de façon précoce: « Stem Cell Factor », cytokines (Interleukines) Facteurs agissant sur la différenciation terminale (« Colony Stimulating Factor ») M-CSF: Macrophage GM-CSF: Granulocyte/Macrophage G-CSF: Granulocyte Erythropoïétine (EPO): globules rouges Thrombopoïétine (TPO): plaquettes

Facteurs de croissance hématopoïétiques Hématopoïèse Facteurs de croissance hématopoïétiques Foie TPO Rein EPO sang Fibroblaste GCSF GMCSF MCSF Monocyte Lymphocyte

Régulation de l’érythropoïèse Hématopoïèse Régulation de l’érythropoïèse EPO Rein Hypoxie Baisse PaO2

La niche ostéoblastique Hématopoïèse La niche ostéoblastique Cellule graisseuse Adhésion/Chimiokines (SDF1/CXCR4) Fibroblastes ostéoclaste Cellule souche ostéoblaste

Facteurs de croissance hématopoïétiques Applications thérapeutiques G-CSF (Neupogen°, Granocyte°) Aplasie fébrile post chimiothérapie Réduction de la durée de la neutropénie post chimiothérapie Agranulocytose médicamenteuse Mobilisation de cellules souches « périphériques » G-CSF Adhésion/Chimiokines (SDF1/CXCR4) Moelle Sang

Facteurs de croissance hématopoïétiques Applications thérapeutiques Erythropoïétine recombinante (Neorecormon°, Aranesp°…): Insuffisance rénale, dialyse Anémie au cours des cancers (chimiothérapie, envahissement médullaire) Myélodysplasie avec [EPO] basse Thrombopoïétine : agonistes du récépteur (MPL) (N-Plate°.. ) Thrombopénie périphérique autoimmune

Hématopoïèse Exploration Frottis sanguin: Goutte de sang étalée sur lame de verre. Coloration May-Grunwald-Giemsa Morphologie des cellules, formule sanguine au microscope

Hématopoïèse Exploration Myélogramme: Biopsie médullaire: Ponction au trocart du sternum ou crête iliaque postérieure puis aspiration Proportions relatives des cellules médullaires (%). Pas de valeurs absolues. 3 étapes: Richesse de la moelle, Pourcentage d’érythroblastes (8-30%), granuleux (50-70%), éléments lymphoïdes (<20%), présence de mégacaryocytes Vérification de l’équilibre « en pyramide » de chaque lignée Biopsie médullaire: Trocart découpant un fragment osseux. Crête iliaque postérieure. Anesthésie locale. Etude histologique, architecture de la moelle, myélofibrose.

Hématopoïèse Pathologique

Pathologie: Hémopathies malignes Hématopoïèse Pathologie: Hémopathies malignes Accumulation de cellules, matures (chronique) ou immatures (aigues) Maladies clonales: dérivent toutes d’une même cellules où est survenu la mutation ou l’évènement transformant Leucémies aigues myéloblastiques et lymphoblastiques Syndromes myéloprolifératifs Syndromes lymphoprolifératifs Myélodysplasies

Pathologie: Hémopathies malignes Hématopoïèse Pathologie: Hémopathies malignes Leucémies aigues: Prolifération de précurseurs hématopoïétiques peu différenciés incapable d’achever leur maturation Insuffisance médullaire: Anémie (pâleur, asthénie); Thrombopénie (hémorragies); Neutropénie (fièvre, infection) Syndrome tumoral: Splénomégalie, adénopathies, Douleurs osseuses, tumeurs localisées Myélogramme: envahissement massif (>20%) par des « blastes »

Pathologie: Hémopathies malignes Hématopoïèse Pathologie: Hémopathies malignes Syndromes myéloprolifératifs Prolifération d’au moins une des trois lignées myéloïdes (GR, Plaquettes, granuleux) sans blocage de maturation: Hyperplasie Evolution: thromboses, fibrose médullaire, transformation « aigues » Hématopïèse extramédullaire (foie, rate) Leucémie myéloïde chronique (translocation t(9;22); chr. Philadelphie; BCR-ABL) Polyglobulie primitive (Maladie de Vaquez): Mutation JAK2 >90% Thrombocytémie essentielle: Mutation JAK2 # 50% Splénomégalie myéloïde (Myélofibrose primitive): Mutation JAK2 # 50%

Syndromes myéloprolifératifs Mutation de la tyrosine kinase JAK2 EPO TPO EpoR MPL JAK2 JAK2 Mutation V617F Prolifération

Pathologie: Hémopathies malignes Hématopoïèse Pathologie: Hémopathies malignes Myélodysplasies Insuffisance médullaire qualitative (« anémies réfractaires ») Défaut de production de cellules myéloïdes, commençant par la lignée rouge, par mort intramédullaire par anomalies qualitatives Evolution vers cytopénies ou transformation en leucémies aigues Anémie sideroblastique acquise Anémie réfractaire simple Anémie réfractaire avec excès de blastes (5-20% de myéloblastes) Leucémie myélomonocytaire chronique

Hématopoïèse Pathologie: Myélemie Définition: Passage de cellules immatures dans le sang Etiologies: Stimulation hématopoïèse Infections sévères avec polynucléoses neutrophiles Régénération médullaire en sortie d’aplasie (G-CSF endogène) Régénération au cours d’anémie hémolytiques massives Hémorragie aigue massive Mobilisation de cellules souches périphériques (G-CSF injecté) Syndromes myéloprolifératifs (LMC, LMMC, SM) Envahissement médullaire (métastase cancer) Myélofibrose

Hématopoïèse Pathologie Aplasies médullaires Insuffisance médullaire avec moelle pauvre/déserte Anémie (pâleur, asthénie); Thrombopénie (hémorragies); Neutropénie (fièvre, infection) Causes: Irradiations ionisantes Chimiothérapies cytotoxiques Infections (hépatites virales, tuberculose) Génétiques (Fanconi) Hémoglobinurie paroxystique nocturne Idiopathiques

Application thérapeutique des cellules souches hématopoïétiques Hématopoïèse: Application thérapeutique des cellules souches hématopoïétiques

Hématopoïèse Transplantation « Greffe » de cellules souches autologues: « Autogreffe » Exemple du traitement intensif du myélome multiple Maladie maligne incurable Prolifération de plasmocytes tumoraux Dans la moelle osseuse Insuffisance médullaire par envahissement Destruction osseuse, hypercalcémie plasmocytes tumoraux Lacunes osseuses du crâne

Chimiothérapie d’induction Chimiothérapie forte dose Melphalan 200 mg/m2 Aplasie Médullaire # 6 mois !!!!!! Chimiothérapie d’induction

Prélèvement de cellules souches hématopoïétiques Moelle osseuse Cellules souches sang. Chimiothérapie forte dose Melphalan 200 mg/m2 Aplasie Médullaire # 15jours Chimiothérapie d’induction Réinjection Cell. souches

Cytapherèses Chimiothérapie de mobilisation (Endoxan+ G-CSF) ou G-CSF seul Chimiothérapie forte dose Melphalan 200 mg/m2 Chimiothérapie d’induction Cytapherèses Réinjection Cell. souches Congélation Cellules souches

Mobilisation des cellules souches hématopoïétiques Administration sous cutané G-CSF seul 10mg/kg 5 jours Test CD34 Présence de cellules CD34+ dans le sang (>10mg/L Cytaphérèse (s) Chimiothérapie induisant aplasie profonde de courte durée puis G-CSF 5mg/kg 10 jours 2. 106 CD34/Kg G-CSF Adhésion/Chimiokines (SDF1/CXCR4) CD34 CD34 CD34 Moelle Sang

Hématopoïèse Transplantation Greffe de cellules souches allogéniques: « Allogreffe » Guérison des hémopathies malignes (leucémies, LMC, aplasie médullaire) Nécessite compatibilité entre donneur et receveur selon le système du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) (carte d’identité des cellules) Age limité (< 60 ans) Toxicité importante due à l’immunosupression pour éviter le rejet et le contrôle de la réaction du greffon contre l’hôte Infections bactériennes, virales, fongiques

Congélation Cellules souches RECEVEUR Immunosupresseur Conditionnement (chimiothérapie, immunosuppresseur, irradiation corporelle) Injection Cell. Souches allogéniques DONNEUR G-CSF seul Sang de cordon Cytapherèses Congélation Cellules souches

Hématopoïèse Transplantation Greffe de cellules souches allogéniques: « Allogreffe » Après l’allogreffe, hématopoïèse 100% donneur (chimérisme complet) Si patient masculin gréffée avec cellules hématopoïétiques de sa sœur Cellules de l’organisme 46,XY mais cellules du sang 46,XX Changement de groupe sanguin

Application au traitement des déficit combinés sévères liés à l’X Hématopoïèse Thérapie génique Application au traitement des déficit combinés sévères liés à l’X X-SCID

Hématopoïèse

Les récepteurs aux cytokines hématopoïétiques

Mutations des récepteurs aux cytokines hématopoïétiques

gc Mutations de la chaine gammaC (gc) Mutation Il2, 4, 7, 9, 15 Déficit Combiné Sévère (SCID) 45%

Thérapie génique IL2Rgc Moelle osseuse sang Cellules souches CSH-LT IL2Rgc Cellules souches Pluripotentes CSH-CT Virus contenant Gène normal PCM PCL PEM PGM Plaquettes Globules rouges Polynucléaire neutrophile Monocyte/ Macrophage Lymphocyte B Lymphocyte T Cellules sanguines matures sang

Thérapie génique Traitement par cellules souches hématopoïétiques transduites par rétrovirus 9/10 enfants « guéris » Mais….. Développement de 2 leucémies aigues (LAL-T) après 3 ans Au total 18 enfants vivants/20 5/20 LAL-T

Hématopoïèse Conclusion Processus complexe de fabrication des éléments du sang Différenciation des cellules souches selon programme génétique et selon l’ environnement médullaire Système très performant et finement régulé plusieurs centaines de milliards de cellules par jour Permet une meilleure compréhension des hémopathies malignes Nombreuses applications thérapeutiques facteurs de croissance Greffes Thérapie génique

Système Immunitaire: Les acteurs auto-renouvellement Cellules souches Système Immunitaire: Les acteurs

Système Immunitaire et hématopoïèse

Réponse immunitaire Microbes Bactéries, virus parasites, champignons Immunité Innée Immunité adaptative Complément CD4 CD8 Cellulaire Lymphocytes T Macrophage Tissus Lymphocyte B Polynucléaire N Cellule Dendritique Humorale Monocyte Plasmocyte NK Phagocytose Migration Périphérie Organes lymphoïdes Ganglion Agression Plaie, effraction Inflammation

Réponse immunitaire Tissu ou organe infecté sang thymus Lymphocyte B Lymphocyte T T Antigène B Cellule Dendritique Lymphocyte B naïf Vx lymph sang B T T Vx lymph Ganglion lymphatique Activation Différenciation Recirculation sang sang T Vx lymph plasmocyte T T effecteur cytotoxique T, B mémoire Anticorps

Réponse immunitaire Cellule dendritique: présentatrice d’antigène Au cœur de la réponse immunitaire

La réponse immunitaire Innée: quelques heures (0-12h) Spécificité limité (groupe de microbes) Diversité limitée Pas de mémoire Adaptative: 1 à 5 jours Spécificité pour antigènes microbien et non microbiens Diversité grande (récepteurs produit par recombinaison ADN) Mémoire: oui (réponse secondaire plus rapide si même antigène) Auto-régulation: Homéostasie Dans les 2 cas Pas de réactivité contre le « soi » (Tolérance) Reconnaissance du soi: « carte d’identité » des cellules: complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)

Réponse immunitaire: chimiokines Tissus Organes lymphoïdes

Réponse immunitaire: cytokines Immunité Innée

Ontogenèse des lymphocytes T et différenciation B Lymphocyte T immature thymus Lymphocyte T mature Progéniteur Commun Cellules souches Organes Ganglion lymphatique Lymphocyte B naïf T effecteur Moelle osseuse B mémoire plasmocyte

Ontogenèse des lymphocytes T et différenciation B Lymphocyte T immature thymus Lymphocyte T mature Progéniteur Commun Cellules souches Organes Ganglion lymphatique Lymphocyte B naïf Moelle osseuse B mémoire plasmocyte

Réponse immunitaire dans le centre germinatif: maturation d’affinité Réseau de cellules Folliculaires dendritiques T plasmocyte T Ag T Ag Cellule B naive B Ag Cellule B mémoire Ag Ag T Formation de B mémoire Sécretion d’Ig Proliferation cellulaire (6-8 h /division) Expansion clonale Puis apoptose massive mutation somatiques Commutation isotypique selection d’isotype par antigene

Réponse immunitaire pathologique

Réponse immunitaire pathologique Ganglions splénomégalie Syndrome Immunoprolifératifs (lymphoprolifératifs) Immunoglobuline monoclonale Déficit Immunitaire: Héréditaire ou acquis, cellulaire et/ou humoral Auto-immunité: Maladies autoimmune systémiques, cytopénie auto-immune Inflammation: Maladie inflammatoire chronique héréditaire ou acquise (polyarthrite rhumatoïde, Crohn, RCH…)

Ontogenèse des lymphocytes T et différenciation B Lymphocyte T immature thymus Lymphocyte T mature Progéniteur Commun Deficit Immunitaire Héréditaire ou acquis Cellules souches Organes Ganglion lymphatique Lymphocyte B naïf Moelle osseuse B mémoire plasmocyte

Auto-immunité et inflammation

Système immunitaire Applications Immunothérapies

Immunothérapies Anticorps monoclonaux (Rituximab, anti-TNF…..) Immunoglobulines polyvalentes Immunosuppresseurs Immunothérapie adoptive (transfert de lymphocytes cytotoxiques) Vaccinations (anti-infectieuse et anti-tumorale) Greffe d’organe et de moelle osseuse