Thrombopénie induite par l’héparine (TIH) de type II : Les tests biologiques

Les tests biologiques Après confirmation de la réalité de la thrombopénie (éliminer une agglutination en EDTA) Les tests biologiques sont réservés à des laboratoires experts, spécialisés. Absence de critère de certitude : pas de «gold standard test» La réalité de la thrombopénie doit être confirmée en éliminant une pseudothrombopénie. Certaines thromboagglutinations persistent avec le tube citraté; il faut dans ce cas contacter le service d'hématologie biologique. 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9 4- Elalamy et al. Spectra Biologie 2000 ; 108 : 34-8

Les tests biologiques Deux types de tests mettant en évidence les Ac Héparine - dépendants : Tests fonctionnels (activation plaquettaire par IgG héparine-dépendantes) Test d’agrégation plaquettaire Test de libération de la sérotonine radio-marquée Tests immuno-enzymatiques (Ac anti F4P-héparine : IgG, IgM, IgA) tests ELISA Deux types de tests permettent de mettre en évidence les anticorps associés aux TIH(2), avec leurs intérêts et leurs limites respectives. - Les tests d'activation plaquettaire Ces tests fonctionnels montrent la présence dans le plasma ou le sérum du malade d'anticorps IgG héparine-dépendants activant les plaquettes de sujets témoins et donc provoquant l'agrégation. - Les tests immunoenzymatiques (ELISA) Ils détectent des anticorps (IgG, IgM, IgA) dirigés contre les complexes F4P-héparine(2). Le prélèvement sanguin pour la détection des anticorps héparine-dépendants doit préférentiellement être effectué après l'arrêt de l'héparine. Le délai de réalisation des tests de détection des anticorps héparine-dépendants et d'obtention de leurs résultats doit être le plus court possible (de façon optimale entre 48 à 72 h). Le délai de résultat de cette démarche biologique ne conditionne pas la prise en charge précoce des patients suspects de TIH(2). 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9

Les tests fonctionnels : Test d’agrégation plaquettaire (TAP) le plus couramment utilisé (en plasma citraté) Le principe est simple : incuber le plasma (ou le sérum) du patient en présence de l’héparine et de plaquettes de témoins. Bonne spécificité (pouvant atteindre 80 %) Sensibilité moyenne : mais pouvant être améliorée (jusqu’à 91 %) par la sélection des témoins, en testant plusieurs témoins et plusieurs concentrations d’héparine. Ne détecte que les anticorps d’isotype IgG. Confirmation du mécanisme immunologique par l’abolition de la réponse en bloquant le CD32 (par un Ac monoclonal IV3). Dans la plupart des laboratoires spécialisés, les tests d’activation plaquettaire reposent sur une méthode dite d'agrégation plaquettaire (AP)(2). Les tests d’agrégation plaquettaire (TAP) sont réalisés en plasma citraté. Ils permettent de détecter les anticorps des patients capables de provoquer l’agrégation des plaquettes de sujets témoins (volontaires sains) en présence d’héparine(2). Ces tests sont de réalisation longue et délicate(2). Si tous les contrôles nécessaires sont effectués, le TAP a une spécificité pouvant atteindre 80%. La sensibilité du test est améliorée et peut atteindre 91% en utilisant les plaquettes de plusieurs sujets témoins(2). Un test négatif en cas de forte suspicion de TIH peut s’expliquer par la présence d’un taux faible d’anticorps dans le plasma du malade et il est conseillé de renouveler cette recherche quelques jours plus tard, qui pourra alors s’avérer positive, en rapport avec le relargage plus important d’anticorps(1). 1- Elalamy I et al. Rev Mal Respir 1999 ; 16 : 961-74 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9 11- Elalamy et al. Feuillets Biol 1998 ; 39 : 9-16

Les tests fonctionnels : Test d’agrégation plaquettaire (TAP) 100 Plasma + HNF 0.5 UI/ml 50 IV-3 + Plasma + HNF 0.5 UI/ml Voici le profil type de TIH d’une réponse agrégométrique de plaquettes témoins avec une cassure de la courbe après un temps de latence plus ou moins long en présence d’héparine et du plasma du patient suspect de TIH. Le plasma du témoin n’est pas capable d’induire cette agrégation de ses propres plaquettes en présence d’héparine. La pré-incubation avec un anticorps monoclonal (IV-3) bloquant le CD32 confirme que la réponse agrégométrique observée est bien de nature immunologique(16) et qu’elle est médiée par le récepteur membranaire du fragment Fc des Immunoglobulines G. 16- Elalamy I, Lecrubier C, Horellou MH, Conarf J, Samama MM. Ann Med 2000 ; 32(1) : 60-7 Plasma témoin + HNF 0.5 UI/ml 5 10 15 20 Temps mn

Les tests fonctionnels : Test de libération de la sérotonine marquée (SRA) Considéré comme le test de référence Mesure la sécrétion de la 14C - sérotonine par des plaquettes témoins lavées exposées au mélange d ’héparine et de plasma du patient. Excellente spécificité Sensibilité de l ’ordre de 80 % Le test de libération de la sérotonine radiomarquée est considéré comme le test de référence. Il mesure la sécrétion de la sérotonine radio-marquée par des plaquettes témoins lavées exposées au mélange d’héparine et de plasma du patient(4). Le lavage des plaquettes témoins accroît la sensibilité des tests d'activation plaquettaire. Toutefois, la sensibilité du test de libération de sérotonine radiomarquée (SRA) n'atteint pas 100 %. En revanche, le SRA a une meilleure spécificité voisine de 100 %(2). Ce test, de réalisation longue et difficile, utilise un réactif radiomarqué et n'est donc réservé qu’à quelques laboratoires spécialisés(2,4). La radioactivité dosée est liée à la libération de la sérotonine marquée contenue dans les granules denses plaquettaires et qui n’est relarguée qu’en cas d’activation provoquée par le plasma du patient suspect en présence d’héparine. NB : L’inhibition de la libération de la sérotonine en présence d'une forte concentration d'héparine (100 UI/ml) est en faveur du mécanisme immunologique de cette activation et donc du diagnostic de TIH (2) 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9. 4- Elalamy et al. Spectra Biologie 2000 ; 108 : 34-8 7- Warkentin TE. In Heparin-Induced Thrombocytopenia – 2d edition - 2001 11- Elalamy et al. Feuillets Biol 1998 ; 39 : 9-16

Les tests fonctionnels : Test de libération de la sérotonine marquée (SRA) Voici le protocole expérimental du test de libération de la sérotonine radiomarquée (SRA). Il est considéré comme étant le test de référence mais il est limité à de rares centres compte tenu des restrictions analytiques liées à la manipulation de produits radioactifs et compte tenu de la complexité de ce test : nécessité de plaquettes de plusieurs témoins et lavage préalable des plaquettes (2 heures).

Les tests immuno-enzymatiques : Test Elisa Accessibles à tous les laboratoires De pratique standardisée et facile Permettent de quantifier les anticorps dirigés contre le F4P complexé à l’héparine (HPIA stago®) ou au polyvinyl-sulfonate (HAT diagast®) Identifie les trois isotypes d ’immunoglobulines (IgG, IgA, IgM) Peut être mis en défaut si la cible antigénique n’est pas le F4P Défaut de spécificité (post CEC : 25 à 35 % de positifs) Défaut de sensibilité (négatif dans 20 % des TIH) Les tests immunoenzymatiques (ELISA) détectent des anticorps (IgG, IgM, IgA) dirigés contre le F4P en présence d'héparine(2). Deux types de tests ELISA sont disponibles en France : l’un détectant les anticorps anti-F4P/héparine (HPIA Diagnostica Stago®) et l’autre proposant une autre cible antigénique couplant le F4P à du polyvinylsulfate (GTI HAT Diagast®). Dans une récente revue de la littérature, Fohlen-Walter et al.(17) ont rapporté que près de 20% des patients ayant une TIH avaient un ELISA anti-F4P/héparine négatif. Par ailleurs, d’autres cibles potentielles sont décrites telles que l’IL-8 ou le NAP-2 dans près de 15% des cas. En fait, la pathogénicité des anticorps détectés est très variable. 17- Fohlen-Walter et al. Does negative heparin-platelet factor 4 enzyme-linked immunosorbent assay effectively exclude heparin-induced thrombocytopenia ? J Thrombo Haemost. 2003 ; 1(8) : 1844-5 12- Amiral J et al. Thromb Haemost 1992 ; 68 : 95-6.

Les tests immuno-enzymatiques : HPIA : Elisa F4P-héparine PUITS d’une microplaque ELISA recouverts de complexes F4P-Héparine ADDITION du plasma (1:100) et liaison des anticorps éventuels (1 h à T.A.) ADDITION d’anticorps de chèvre anti-humain IgG, A, M couplés à la peroxydase (1 h à T.A.) DETECTION par le substrat OPD/H2O2 (5 min.) réaction stabilisée par H2SO4 (A492 nm) Voici le protocole expérimental de l’ELISA le plus souvent réalisé en France : HPIA Diagnostica Stago®.

Autres tests biologiques D’autres techniques ont été décrites pour le diagnostic biologique des TIH mais ne sont pas validées la cytométrie en flux Recherche une expression membranaire d’antigènes témoins d’une activation plaquettaire (CD62 ou P-sélectine) ou une émission de microparticules phospholipidiques (Annexine V) La bioluminescence Mesure le relargage d’ATP par les granules denses plaquettaires en cas d’activation immunologique héparine dépendante. D’autres tests sont proposés tels que la cytométrie en flux (expression d’annexine V) mais leur pertinence diagnostique n’a pas encore été validée en pratique clinique(1). Ils permettent la recherche de réactivité croisée mais les adaptations analytiques pour une amélioration des performances restent à optimiser. 1- Elalamy I et al. Rev Mal Respir 1999 ; 16 : 961-74

Limites et interprétation des tests Défaut de sensibilité et de spécificité Possibilité de discordance entre les 2 types de tests Complémentarité des 2 types de tests Un test négatif n’exclut pas une TIH… La clinique et la cinétique des plaquettes à l’arrêt de l’héparine sont des critères essentiels du diagnostic de TIH de type II Compte tenu de leurs limites respectives, les deux types de tests (ELISA et activation plaquettaire) sont complémentaires et permettent d'améliorer le diagnostic de TIH. Il est donc nécessaire d'effectuer systématiquement une recherche immunologique d'anticorps anti-F4P et un test fonctionnel (AP ou SRA)(2). - si les 2 tests sont positifs, le diagnostic de TIH est très probable (valeur prédictive positive proche de 100 %) ; - si les deux tests sont négatifs le diagnostic de TIH est peu probable. Cependant si la probabilité clinique de TIH est assez élevée, ce diagnostic de TIH ne peut être formellement exclu ; - plus rarement, dans une authentique TIH, un seul des tests peut être positif ; - si seul le test ELISA est positif, il peut s'agir d'une vraie TIH liée à la présence d'anticorps de classe IgA ou IgM qui n'activent pas in vitro les plaquettes. Toutefois après chirurgie cardiaque avec CEC un résultat positif du seul test Elisa n'est pas suffisant pour retenir la diagnostic de TIH(2). 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003; 22 : 150-9. 2- Conférence d’experts -2002-texte court. Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 2003 ; 22 : 150-9 4- Elalamy et al. Spectra Biologie 2000 ; 108 : 34-8

Discordances et limites des tests Complexes TAP ELISA IgG / F4P-héparine + IgA ou IgM (sans IgG) / - Autre cible-héparine IgA ou IgM sans IgG / Ce tableau résume les limites de ces deux types de tests et illustre leur complémentarité. 4- Elalamy et al. Spectra Biologie 2000 ; 108 : 34-8

Discordances et limites des tests Après une première exposition : SRA médiane : 50 jours (IC 95 % : 32-64) Elisa médiane : 85 jours (IC 95 % : 64-124) No AT RISK Antigen assay Activation assay La cinétique des anticorps est variable d’un sujet à l’autre. Cette courbe montre la proportion de patients chez qui les anticorps héparine-dépendants restent détectables après un épisode de TIH (8) . La détection de ces anticorps est différente selon le test utilisé. Il apparaît que le test ELISA se négative plus lentement que le test fonctionnel(8) (donc il est capable de détecter ces anticorps plus tardivement). NB : Il contre-indiquerait alors la réalisation d’une CEC chez un patient TIH sous HNF par exemple. 8- Warkentin TE N Engl J Med 2001; 344 : 1286-92 8- Warkentin TE N Engl J Med 2001; 344 : 1286-92

Limites des tests : Hétérogènéité des anti-F4P-Héparine Sous HNF : 15 % avec anticorps dont 10 % (= 1,5 %) feront une TIH Sous HBPM : 8 % avec anticorps dont < 5% (= < 0,4 %) feront une TIH Après chirurgie orthopédique (sous HNF) 15 % avec anticorps dont 1/3 (= 5 %) feront une TIH Après chirurgie orthopédique (sous HBPM) 7,5 % avec anticorps dont 12 % (= 0,9 %) feront une TIH Après chirurgie cardiaque 50 % avec anticorps dont 5 % (= 2,5 %) feront une TIH En fait, la pathogénicité des anticorps détectés est très variable. Ainsi, parmi les 15% de patients présentant une seroconversion sous HNF, seuls 1,5% feront une authentique TIH. Pour les HBPM, sur les 8 % de patients ayant des anticorps seuls 0,4 % développeront une TIH. En chirurgie cardiaque près de 50 % des patients ont des anticorps en post-CEC mais seulement 2,5 % se compliqueront de TIH. Ainsi, il existe une dissociation population-dépendante entre le risque de formation d’anticorps et le risque de TIH chez les patients ayant développé des anticorps(13) : La formation d’anticorps est plus importante après chirurgie cardiaque qu’après chirurgie orthopédique, mais parmi les patients développant des anticorps, la TIH survient préférentiellement chez les patients orthopédiques(13). 13- Warkentin TE. Blood 2000 ; 96 : 1703 6- Warkentin TE. In Heparin-Induced Thrombocytopenia – 2d edition - 2001 13- Warkentin TE. Blood 2000 ; 96 : 1703

Limites des tests : Hétérogénéité pathogénique des anticorps Capacité des anticorps à induire une TIH Profil variable : Réactivité anti-F4P/héparine, Anti F4P : isotype IgG,IgA,IgM Activation plaquettaire (SRA) : Obtenue avec les anticorps anti-F4P/héparine à forte affinité Autres facteurs requis pour induire une TIH Activation plaquettaire, IgG, densité FCRII, ratio F4P/héparine Les anticorps héparine-dépendants sont donc hétérogènes tant en termes d’affinité que de spécificité pour les antigènes cibles et cela pourrait influencer leur capacité à activer les plaquettes et leur pathogénicité(12). Les facteurs responsables de cette pathogénicité restent à déterminer : activation plaquettaire, IgG, densité FcgRII, ratio F4P/héparine. L’affinité des anticorps semble un paramètre important et leur détection par un test fonctionnel serait utile pour la prise en charge précoce de ces patients. 12- Amiral et al. Br J Haematol 2000 ; 109(2) : 336-41 12- Amiral et al. Br J Haematol 2000 ; 109(2) : 336-41

Discordances et limites des tests SRA négatif SRA positif Libération de la sérotonine (SRA) 2 tests négatifs 1 seul test positif 2 tests positifs TIH possible Autre cause ? TIH très vraissemblable TIH non Agrégation plaquettaire ELISA 4- Elalamy et al. Spectra Biologie 2000 ; 108 : 34-8 10- Gruel Y, Pouplard C. STV 1999 ; 11 : 439-47