Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain

Rhabdovirus RNA monocat-, 11-15 Kb Une seule glycoprotéine: G

Principe Le but est d’insérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine) L’ensemble est injecté, la glycoprotéine est exprimée immunisation

Préparation de l’insert Etape 1: excision de la queue polydG ATG TAC ATG TAC ATG Oligonucléotide double brin TAC ATG= codon initiateur

Préparation de l’insert Etape 2: correction de l’aa n°8 CTA ATG GAT TAC CCA GGT CCA ATG GGT TAC Hind III

Préparation du plasmide tk ADN viral Hind III Gène Thymidine kinase tk clonage

Préparation du plasmide tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

Production de virus recombinant Ca2+ Insert Géne nts Virus vaccinal ts Culture de cellule Ts = thermosensible, nts = non ts

Sélection des recombinants Incubation à température non permissive Recombinants nts Culture de cellule

Sélection des recombinants Culture sur cellules tk - Recombinants nts et tk- Culture de cellule + BrdUrd BrdUrd = substrat tk

Vérification Digestion ADN par Hind III Electrophorèse: 2 fragments (1,1 + 5,5 Kb): OK Si 1 fragment (4,6 Kb): non recombinant Southern blotting: hybridation avec DNA de la glycoprotéine rabique

Préparation du plasmide tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

Essais in-vitro Infection cellules tk- Forte immunofluorescence avec des Ac anti-gp La synthèse est donc efficiente Immunoprécipitation: par sérum polyclonal autant que par 2 Ac monoclonaux (bande à PM de 66000: correspond à la glycoprotéine rabique)

Essais in-vivo Injection intra-dermique chez la souris: résiste à des épreuves d’infection à haute dose

Conclusion La glycoprotéine produite est qualitativement indistingable de la protéine native Les virus atténués comme le virus vaccinal sont des vecteurs particulièrement appropriés pour la production de vaccins (à été utilisé pour smallpox, hépatite B, influenza et herpès)

Biblio Kieny M.P. et al., 1984 : expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312, 163-166 Blancou J. et al., 1986 : oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature, 322, 373-375 Pastoret P.P. & Brochier B., 1996: the developement and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect., 116, 235-240