Muriel Perron Bât. 445 Cours Master 2 Octobre 2006 http://www.umr8080.u-psud.fr/coursBD.html Les cellules souches neurales Muriel Perron Bât. 445 Cours Master 2 Octobre 2006

Plan du cours Les cellules souches: généralités Les cellules souches neurales Les cellules souches de la rétine La signalisation moléculaire

Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche a la capacité unique de: s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée produire différentes cellules spécialisées (différenciées)

Qu’entend-on par auto-renouvellement? Divisions asymétriques La division d’une cellule souche est asymétrique - les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère

Où trouve-t-on des cellules souches? Les cellules souches embryonnaires dérivent de la masse interne du blatocyste (embryon de 4-5 jours) Les cellules souches adultes dérivent de tissues adultes

Les cellules souches embryonnaires ou cellules ES Pluripotentes potentiel de produire tous les types cellulaires (plus de 200 différents types de cellules)

Les cellules souches adultes Multipotentes

Rôle des cellules souches? Les cellules souches EMBRYONNAIRES produisent des progéniteurs qui, à leur tour, se différentient en cellules spécialisées créant tissus et organes Les cellules souches ADULTES participent au renouvellement et à la réparation des tissus adultes

Plasticité innatendue des cellules souches adultes Le dogme voulait que chaque organe héberge les cellules souches spécialisées qui lui sont propres. Or selon les conditions de culture, ou dans des expériences de transplantations cellulaires, des cellules souches adultes peuvent se différencier en cellules d’un tissu dont elles ne proviennent pas

Plasticité innatendue des cellules souches adultes rescue lethally irradiated mice. Les cellules souches de la moelle osseuse peuvent se différencier en cellules nerveuses, du foie, du muscle cardiaque, du muscle squeletique…

Remise en question de la plasticité des cellules souches adultes Dans certains cas des chercheurs ont suspecté des phénomènes de fusion cellulaire qui pourraient être responsables d’une partie de ces observations de plasticité des cellules souches. Mais la fusion cellulaire est un évênement rare qui ne permet sans doute pas d’expliquer toutes les observations de “transdifférenciation”.

Environnement stable pour les cellules souches Concept de niches Environnement stable pour les cellules souches Les niches sont des ensembles de tissus et de matrices extracellulaires qui peuvent indéfiniment héberger des cellules souches et contrôler leur auto-renouvellement et leur production cellulaire in vivo.

Potentiel médical des cellules souches Les cellules souches pourraient un jour remplacer les cellules endommagées dans le corps. Médecine régénérative Specific Tissues can be grown from Stem cells under special conditions

Potentiel médical des cellules souches Aujourd’hui : lymphome, leucémie. Demain? Parkinson, maladies cardiaques, diabète…

Sources de cellules souches embryonnaires Embryons excédentaires provenant de cliniques de fécondation in vitro (FIV) Embryons créés à des fins de recherche par FIV Lignées de cellules souches embryonnaires existantes Transfert de noyau d’une cellule somatique Il est possible de produire des cellules souches embryonnaires à partir d’une cellule somatique adulte par transfert de noyau; le noyau d’une cellule adulte est ainsi fusionné avec un ovule dont on a retiré le noyau.

Transfert de noyau d’une cellule somatique Les clonages thérapeutiques et reproductifs commencent tous deux par un transfert de noyau d’une cellule somatique, mais le clonage reproductif permet au blastocyste de se transformer en un fœtus. Le clonage thérapeutique a pour but de récolter des cellules souches embryonnaires en vue de mener des recherches sur d’éventuels traitements  l’embryon sert à fabriquer des cellules souches embryonnaires. Le clonage reproductif a pour but de créer un nouvel organisme, identique à la cellule adulte donneuse  le blastocyste est implanté dans l’utérus.

Les premières expériences de transplantation nucléaires Tadpole (frog larva) Intestinal cell Frog egg cell Nucleus UV Nucleus destroyed Transplantation of nucleus Eight-cell embryo Tadpole 1962 Le clonage de têtards a montré que les noyaux de cellules animales différenciées gardaient tout leur potentiel génétique. Gurdon, 1962

La première expérience de transplantation nucléaire chez un mammifère Le 1er mammifère cloné s’appelle Dolly et a été produit en 1997

Débat éthique Les cellules souches embryonnaires pourraient sauver de nombreuses vies. Il faut effectuer des recherches sur les cellules souches embryonnaires.

Débat éthique (suite) Récolter des cellules souches embryonnaires à partir d’un embryon précoce le détruit.

Débat éthique (suite) « Le clonage thérapeutique mènera au clonage reproductif».

Législation relative aux cellules souches embryonnaires  Les recherches sur les embryons humains et les cellules souches humaines sont-elles autorisées en France ?   La recherche sur les embryons humains fait l'objet d'une législation, qui varie suivant les pays. En France, la loi du 29 juillet 1994 permet uniquement les recherches sur les cellules de foetus obtenus à la suite d'une interruption volontaire de grossesse. le clonage est interdit quel qu'il soit, reproductif ou thérapeutique Le projet de loi relatif à la bioéthique du 20 juin 2001 a notamment pour objet d'autoriser les recherches sur l'embryon et les cellules souches embryonnaires sous certaines conditions : Les recherches ont une finalité médicale qui ne peut pas être atteinte avec la même efficacité par une autre méthode Les deux membres du couple à l'origine de l'embryon en ont fait explicitement don à la recherche Les protocoles expérimentaux ont été dûment autorisés par les ministres concernés après avis de l'agence de la procréation, de l'embryologie et de la génétique humaine.

Législation relative aux cellules souches embryonnaires Pays Clonage thérapeutique Création d’embryons à de s f i n d e recherche Utilisation ’ embryons excédentaires provenant de cliniques de FIV Utilisation de lignées de cellules SE existantes R. - U. 3 É. ? Canada 7 Allemagne France

Différences entre cellules souches adultes et cellules souches embryonnaires Différenciation limitée : multipotent + plasticité Rares dans les tissus matures Difficiles à cultiver en culture Plus “éthiques” que les cellules souches embryonnaires Embryonnaires Différenciation illimitée: pluripotent Présentes en grand nombre Faciles à cultiver en culture

Plan du cours Les cellules souches: généralités Les cellules souches neurales Les cellules souches de la rétine La signalisation moléculaire

Neurogenèse adulte? Dans certains tissus, la perte de cellules, naturelle ou après une blessure, est compensée par la prolifération et la différenciation de cellules souches. Un dogme en neurobiologie disait qu’étant donné que la perte de neurones dans le CNS, dus à des processus dégénératifs, ne sont pas remplacés, le CNS des mamifères ne possède pas de population de cellules souches. “We are born with a certain number of brain cells which decrease with age. Everything must die in the brain or spinal cord - nothing can regenerate.” Ramon y Cajal 1902

Neurogenèse adulte? Le premier indice suggérant l’existence de neurogenèse dans certaines régions du cerveau de mammifère date de 1965 (marquage en thymidine tritiée). C’est seulement en 1993, grâce à de nouvelles techniques de marquage des cellules en prolifération (retrovirus, BrdU), que ceci a clairement été montré. La première évidence de cellules capable de s’auto-renouveler et multipotentes dans le cerveau date de 1996.

Qu’est ce qu’une cellule souche neurale? Une cellule souche neurale a la capacité de s’auto-renouveler et de donner les trois types majeurs du CNS des mammifères: les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes

Où trouve-t-on des cellules souches neurales? Régions principales où de la neurogenèse a lieu pendant toute la vie adulte (en gris): Bulbe olfactif Hippocampe Régions qui contiennent les cellules souches (en noir): Zone subventriculaire Gyrus denté De la neurogenèse est à présent également trouvée dans le cervelet, le cortex… Galli et al., 2003

Les cellules souches de la zone subventriculaire Environ 30 000 nouveaux neuroblastes sont produits chaque jour qui migrent vers le bulbe olfactif Taupin et Gage, 2002; Galli et al, 2003

Quelle est l’origine des cellules souches neurales? “Reste” de cellules souches embryonnaires? Ependymal cells? Glie radiale? Astrocytes? 2003

Comportement ex vivo des cellules souches neurales Okano, 2002

Plasticité des cellules souches neurales en dehors du SNC innatendu Après injections intraveineuses, des cellules souches neurales adultes sont capables de donner des cellules hématopoïétiques. Science 1999

Potentiel de différenciation innatendu Après co-culture avec des myoblastes ou injection dans le muscle squeletique, des cellules souches neurales adultes sont capables de donner des cellules musculaires.

Régénération de neurones à partir des cellules souches endogènes après une attaque cérébrale Potentiel de régénération à partir des cellules souches neurales endogènes Mais 80% des nouveaux neurones meurent. Seuls environ 0,2% des neurones détruits sont remplacés. Stimuler la formation ou la survie des nouveaux neurones (FGF-2, EGF, brain-derived neurotrophic factor, cascase inhibitors)

Modulation of neurogenesis in the adult brain Taupin, C. R. Biologies, 2006

Function of these newborn? Adult-generated neurons participate in modulating memory function Thousands of new neurons are continuously produced in the dentate gyrus. Function of these newborn? Exposure of animals to an enriched environment leads to improvement of performance in several learning tasks and enhances neurogenesis specifically in the hippocampus. Do these new neurons participate in memory improvement induced by enrichment? S. Laroche Experiment: Neurogenesis was reduced throughout the environmental enrichment period using the antimitotic agent methylazoxymethanol acetate (MAM). Result: MAM treatment completely prevented the enrichment-induced long-term memory improvement. Bruel-Jungerman et al., 2006

Plan du cours Les cellules souches: généralités Les cellules souches neurales Les cellules souches de la rétine La signalisation moléculaire

Les cellules rétiniennes Photoreceptors, rods and cones, are found in the outer layer of the retina. Their outer segments are membranous structures that capture light and carry out phototransduction. They form synapses with bipolar and horizontal cells, found in the inner nuclear layer. Also in the inner nuclear layer are amacrine cells, which synapse with bipolar cells and the output cell type, ganglion cells. Ganglion cells then send the result of all of this processing to the brain via the optic nerve.

La rétine: Introduction Analyse clonale: Les rétinoblastes sont multipotents

La rétine des amphibiens et des poissons

La rétine des amphibiens et des poissons Prolifération Sortie du cycle cellulaire Rétine mature

Les cellules souches rétiniennes des amphibiens Epithélium pigmenté Cellules souches Rétine neurale Neuroblastes Précurseurs en différenciation Cristallin ZMC Nerf optique ZMC = zone marginale ciliaire Harris et Perron, 1998

2000

Les cellules souches rétiniennes des mammifères En culture, les cellules de l’épithélium ciliaire sont capables de former des neurosphères … Tropepee et al. 2000, Ahmad 2001

Les cellules souches rétiniennes des mammifères Fig. 8. Cultured cells from the pigmented region of the pars plana and plicata of humans. (A) A cell colony derived from pigmented cells of the pars plana and plicata of the adult human eye grown in the presence of EGF and then plated onto a coverslip coated with poly-ornithin and laminin. (B) An example of neuronlike cells derived from such colonies (immunolabelling with an antibody directed against the b-tubulin-III antigen). (Courtesy: Dr Yvan Arsenijevic). Colonie de cellules dérivées de corps cilaire de rétine Exemple d’une cellule neurale dérivée d’une telle colonie … et de se différencier en divers types de neurones rétiniens Tsonis 2004

Les cellules souches rétiniennes des mammifères Le corps ciliaire a deux fonctions : la sécrétion de l'humeur aqueuse l’accommodation (le muscle ciliaire permet l'accomodation par les changements de forme du cristallin) Le corps ciliaire est situé entre l’iris et la rétine neurale Origine embryonnaire commune avec la rétine neurale

Stem cells ‘could restore vision’………

Les maladies dégénératives oculaires En France, environ 40 000 personnes sont concernées par les maladies dégénératives oculaires héréditaires et plus de 1,5 million par les dégénérescences maculaires liées à l'âge. Les formes les plus fréquentes de dégénérescences rétiniennes sont: la rétinite pigmentaire (35 000 personnes en France) le syndrome de Usher (1 naissance sur 25 000) les dégénérescences de la macula (10 % de la population de plus de 50 ans)

Traitements de maladies dégénératives oculaires 2001 Figure 3. The possible uses of neural stem cells in the treatment of ocular degenerative diseases. Cultured neural stem cells-progenitors can be transplanted to repopulate degenerating retina ( off-color photoreceptors) by differentiating into photoreceptors ( blue photoreceptors). Intrinsic neural stem cells-progenitors, such as those in the ciliary body, can be activated to proliferate, migrate to the site of degeneration, and differentiate into missing photoreceptors. Cultured neural stem cells-progenitors can also be genetically engineered to synthesize and secrete neuroprotective factors and can be used to rescue degenerating photoreceptors ( off-color photoreceptors). In addition to promoting survival, the genetically modified cells can differentiate into photoreceptors ( blue photoreceptor) and reconstruct the degenerating retina. The cultured neural stem cells-progenitors from ocular tissues offer a model of retinal development in vitro. These cells can be used to screen drugs and neuroprotective factors that promote survival of retinal cells and can also be used to identify differentiation and survival genes, by using DNA microarray technology. Bent arrows, secretion of neuroprotective factors.

Transplantation into the mouse eye The EGFP human RSCs and progeny are able to survive and integrate into the neural retina and the RPE. Coles et al., PNAS 2005

Limitations Disponibilité des cellules souches rétiniennes limitée Manque de connaissances de la reproductibilité des expériences de transplantation Etablissement des connections avec les autres neurones Potentiel oncogénique

Les cellules gliales de Müller: des cellules souches rétiniennes ? BrdU + Müller BrdU + Neuron Fig. 7. Mu¨ller glia cells respond to retinal damage in the post-hatched chick by re-entering the cell cycle and eventually differentiating into retinal neurons expressing neural retinal markers such as Hu. (A) Retinal damage was induced with N-methyl-D-aspartate (NMDA). Two days post-treatment, eyes were positive for BrdU and (B) for glutamate synthatase (GS), a Mu¨ ller glia marker. (C) An overlay of images A and B. Scale bar ®˘ 50 mm. Mitotically active cells (100%) were Mu¨ ller glial cells (D) Fourteen-days later, cells were still positive for BrdU and were also (E) positive for Hu, a retinal neuron cell marker. (F) An overlay of images D and E showing that BrdU positive cells were also positive for Hu. Réponse des cellules gliales de Müller à une dégénération rétinienne induite au N-methyl-D-aspartate (NMDA) Tsonis 2004

Plan du cours Les cellules souches: généralités Les cellules souches neurales Les cellules souches de la rétine La signalisation moléculaire

Fonction chez l’adulte? Multipotence? Fonction chez l’adulte? Auto-renouvellement?

Stem cell niches in zebrafish retina Raymond et al., BMC Developmental Biology, 2006

Development 2005

La cascade de signalisation Hedgehog

Objective Investigate the possible involvement of the Hh pathway in the control of stem cell lineages in the postnatal and adult forebrain SVZ

Gene expression in single SVZ cells 17% of the cells co-expressed both genes, confirming that one population of GFAP+ cells, known to be stem cells, express Gli1 Not all GFAP+ cells expressed Gli1 Many Gli1+ cells did not express GFAP, suggesting that more abundant precursors also respond, or may have recently responded, to Shh signaling single cell multiplex RT-PCR from single randomly collected SVZ cells with a patch-clamp pipette

Cyclopamine inhibits SVZ cell proliferation in vivo cyclopamine injection BrdU injection harvest tissus after 2 hours

Reduced number of newborn interneurons in the adult olfactory bulb after cyclopamine treatment. cyclopamine injection BrdU injection harvest tissus after 30 days

Shh signaling regulates SVZ proliferation and neurogenesis.

Shh treatment increases the number of neurospheres culture with or withour Hh for 4 days dissociated Culture in EGF for neurosphere formation for 1 week

Fonction chez l’adulte? Bilan Hedgehog Wnt Notch Retinoic acid BMI-1 Auto-renouvellement? Multipotence? Fonction chez l’adulte? Croissance Réparation Mémoire

Cellules souches et cancer 2001

Brain tumour stem cells Première évidence de cellules issues de tumeurs du cerveau ayant des caractéristiques de cellules souches: 2002 Reviewed in Vescovi et al., Nature reviews 2006

Brain tumour stem cells autorenouvellement (neurospheres) autorenouvellement in vivo (capacité d’initier une tumeur) multipotence (astrocytes + neurones) expression de marqueurs de cellules souches neurales

Origine des cellules souches cancéreuses? Hypothèse traditionnelle: dédifférenciation d’une cellule neurale en réponse à des altérations génétiques Concept du “cancer stem cell”: similitudes entre auto-renouvellement des cellules souches neurales et des cellules cancéreuses Les cancers pourraient dériver d’une cellule souche dont les mécanismes d’auto-renouvellement seraient dérégulés

Cellules souches et cancer Figure 2 Signalling pathways that regulate self-renewal mechanisms during normal stem cell development and during transformation. Wnt (refs 25, 27; and T.R. et al ., submitted), Shh 19, 78, 79 and Notch pathways 17, 80, 81 have been shown to contribute to the self-renewal of stem cells and/or progenitors in a variety of organs, including the haematopoietic and nervous systems. When dysregulated, these pathways can contribute to oncogenesis. Mutations of these pathways have been associated with a number of human tumours, including colon carcinoma 37 and epidermal tumours 82 (Wnt), medulloblastoma 83 and basal cell carcinoma 84 (Shh), and T-cell leukaemias 85 (Notch). (Images courtesy of Eye of Science/SPL and R. Wechsler-Reya/M. Scott/Annual Reviews.)

Cellules souches et cancer Figure 1. Les traitements anti-cancéreux traditionnels (en haut) tuent rapidement les cellules tumorales en division (rouge) mais leurs effets sont souvent transitoires, suggérant la persistance de cellules souches cancéreuses (bleu), à l’origine de la récurrence tumorale. L’enjeu actuel (en bas) consiste à développer des outils thérapeutiques capables de cibler directement les cellules souches cancéreuses, afin d’obtenir des rémissions à plus long terme.

Risques de tératomes dans les greffes de cellules souches L’implantation de cellules ES de souris dans le cerveau de souris conduit à la formation de tératomes dans 20% des cas. Le risque est réduit si les cellules ont été préalablement différenciées in vitro.

Mais encore… Combien de différents types de cellules souches existe-t-il chez l’adulte? Quelle est la source des cellules souches adultes? Pourquoi les cellules souches restent-elles indifférenciées quand toutes les cellules autours d’elles se sont différenciées? Est-ce que les cellules souches adultent présentent normalement une certaine plasticité ou bien est ce qu’elles se trans-différencient uniquement quand les scientifiques les manipulent expérimentalement? Quels sont les signaux qui régulent la prolifération, la différenciation, la plasticité des cellules souches? http://stemcells.nih.gov/info/scireport/