LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION Patrick BERTRAND Professeur à l’Université de Provence Aix-Marseille 1 Collège de France, 8 avril 2009 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

SRED + AOx  SOX + ARED SRED SOX AOX ARED SRED SOX site actif e- e- e- H+ AOX ARED SRED SOX site actif e- e- e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 centres rédox e- e- Q e- AOX ARED quinone H+ ENZYME D’OXYDO-REDUCTION COMPLEXE BIOENERGETIQUE

LES PROPRIETES EXTRAORDINAIRES DES ELECTRONS CAS D’UN ELECTRON LIBRE Probabilité de présence: ( (x,t) )2 (x,0) x0 t = 0 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 x (x,t) Instant t x(t) x L’électron se délocalise spontanément A quelle vitesse ?

x(t) = UN PETIT CALCUL - électron (me = 9,1 x 10-31 kg) avec x0 = 1Å x = 12 Å t = 10-15 s x = 1,2 mm t = 10-9 s objet d’un kilogramme avec x0 = 0,1 mm x = 1mm pour t = 30 x 1018 ans (âge de l’Univers : 13 x 109 ans) P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

vibrations moléculaires DANS LES MOLECULES, LES ELECTRONS NE SONT PAS LIBRES ! Charge négative : interagissent avec les noyaux et les autres électrons Mais très petite masse  délocalisation dans des orbitales moléculaires : notion de densité électronique s’ adaptent instantanément aux variations de géométrie: P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 vibrations moléculaires La densité électronique s’étire et se contracte en suivant les mouvements des noyaux

LES TRANSFERTS D’ELECTRONS A LONGUE DISTANCE énergie potentielle ARED BOX état initial ER Qi initial final Ea U P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 Q* Qi Q* Qf géométrie k  P exp(- Ea /RT ) AOX BRED état final Qf

EXPRESSION DE LA CONSTANTE DE VITESSE Analyse plus détaillée (R. Marcus, Prix Nobel de Chimie 1992) U remplacé par G° (variation d’enthalpie libre standard de la réaction) G° = - ℱ E°, avec E° = E°B - E°A potentiels rédox standards P : facteur électronique : carré recouvrement des orbitales (distance et masse) P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

état initial état final ARED BOX AOX BRED k1 k-1 ET LE TRANSFERT INVERSE ? état initial état final ARED BOX AOX BRED k1 k-1 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 k1 et k-1 : même P et même ER , mais G°  - G° k1 /k-1 = exp(-G°/RT)

UNE PROPRIETE REMARQUABLE : VARIATION DE k1 AVEC E° E° = E°B – E°A k-1 E°A E°B ln k1 ln k-1 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 pente = 1/2RT ℱ E° ER Dans les molécules biologiques : ℱ E° < ER ( 0,5 à 1 eV) régime « normal » : k1 augmente avec E°

Sazanov et al., Science (2005, 2006) DES CHAINES DE TRANSFERT D’ELECTRON DANS LES ENZYMES P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 LE COMPLEXE I MITOCHONDRIAL Sazanov et al., Science (2005, 2006)

A B A B C D COMMENT OPTIMISER UNE CHAINE DE TRANSFERT D’ELECTRON ? k1 E° = E°B – E°A k1 / k-1 = exp(ℱ E°/ RT) A UN MAILLON : B k-1 E°A E°B Pour privilégier le transfert de A vers B ( k1 >> k-1 ) : ℱ E° >> RT à T = 300 K , E° = 100 mV  k1 /k-1 = 50 E° = 200 mV  k1 /k-1 = 2500 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 UNE CHAINE « DIRECTIONNELLE » k1 k2 k3 A B C D k-1 k-2 k-3 E°A E°A+100 mV E°A+200 mV E°A+300 mV

LA NATURE PROCEDE -T- ELLE AINSI ? LE PRIX A PAYER k1 k2 k3 ? A B C D ACCEPTEUR k-1 k-2 k-3 E°A E°A+ 100 mV E°A+ 200 mV E°A+ 300 mV Les électrons sur D ont perdu beaucoup de leur pouvoir réducteur  La biosynthèse des centres rédox coûte cher aux organismes vivants P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 LA SOLUTION : DIMINUER LE NOMBRE D’INTERMEDIAIRES k1 A ACCEPTEUR B k-1 E°A + 100 mV transfert d’électron à longue distance E°A LA NATURE PROCEDE -T- ELLE AINSI ?

h DRED DOX e- extrêmement rapides e- P e- e- AOX ARED LA NATURE A TRES BIEN FAIT LES CHOSES DANS LES CENTRES REACTIONNELS DE LA PHOTOSYNTHESE énergie lumineuse Catalysent les réactions : DRED + AOX +  DOX + ARED DRED DOX e- Les transferts doivent être extrêmement rapides pour que les électrons arrivent sur l’accepteur h e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 P e- e- AOX ARED

LE CENTRE REACTIONNEL BACTERIEN h P870 B e- 17 Å H 13 Å QB QA P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 18 Å P* HOX QA OX 3 x 1011 s-1 POX HRED QA OX 5 x 109 s-1 h 109 s-1 POX HOX QA RED 108 s-1 104 s-1 10 s-1 (25 Å) P HOX QA OX

Les centres fer-soufre QU’EN EST-IL DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION « ORDINAIRES » ? LES CENTRES REDOX Les centres fer-soufre Les hèmes P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 2Fe-2S 3Fe-4S 4Fe-4S

La succinate deshydrogénase (Complexe II mitochondrial) fumarate succinate site actif : flavine +30 mV - 80 mV 13 Å 2Fe-2S 0 mV P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 14 Å 4Fe-4S - 260 mV e- 13 Å UQH2 + 60 mV UQ 3Fe-4S + 60 mV ubiquinone Structure : Iverson et al., Science (1999) UQ UQH2 + 60 mV

LES HYDROGENASES A NICKEL-FER site actif : Ni-Fe 2 H+ H2 - 350 mV - 420 mV 12 Å 4Fe-4S - 350 mV 12 Å P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 3Fe-4S + 65 mV 12 Å 4Fe-4S e- - 350 mV cytochrome red cytochrome ox - 300 mV cytochrome - 300 mV Structure: Volbeda et al., Nature (1995)

Les transferts d’électrons limitent-ils l’activité des enzymes ? Que faut-il en déduire ? Les transferts d’électrons limitent-ils l’activité des enzymes ? Les potentiels rédox mesurés sont-ils pertinents ? La théorie du transfert d’électron doit-elle être révisée ? Il faut comparer - l’activité des enzymes - la vitesse des transferts d’électron P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

ACTIVITE DES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION mélange (SRED, AOX) A t = 0, on ajoute l’enzyme et on mesure la vitesse initiale : vi = SRED SOX site actif vi proportionnelle à [enzyme] : activité (M s-1) dépend de processus très variés intermoléculaires : diffusion SRED site actif AOX site favorable au TE intramoléculaires : chimie au site actif transferts de protons transferts d’électrons e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 centres rédox e- e- AOX ARED

SOX SRED e- e- e- AOX ARED LA CONSTANTE CATALYTIQUE kCAT Quand [SRED]0 et [AOX]0 assez grandes (saturantes) : Vi ne dépend que des processus intramoléculaires Vi = kCAT [enzyme] cycle catalytique SOX SRED e- E kCAT = nombre de cycles par seconde k1 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 e- E4 E1 modèle cinétique  kCAT = f(k1, k2, k-2, …) e- k-2 k2 AOX ARED E3 E2 Si étapes quasi irréversibles : 1/kCAT = 1/k1 + 1/k2 + 1/k3 + 1/k4 + 1/k5 Notion d’étape limitante

SRED SOX e- e- (rapide) e- LES LACCASES Substrats aromatiques E°’ très positifs SRED SOX Champignons, plantes, insectes, bactéries Enzymes peu spécifiques Applications biotechnologiques MOX MRED médiateurs S met e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 E°’  + 400 à + 800 mV Cu S cys His N T1 N His e- (rapide) site actif (Cu trinucléaire) e- transfert d’électron médiateur  T1 : limitant ? Etude bibliographique O2 2H2O + 940 mV pH 5

VARIATION DE kCAT EN FONCTION DE E° = E°’(T1) – E°’(med) Série de 10 laccases, même médiateur médiateur (non phénolique) = ABTS E°’= + 700mV, pH 5 kCAT (s-1) pente = 1/(2RT) ln k1 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 ER ℱ E°

VARIATION DE kCAT EN FONCTION DE E° = E°’(T1) – E°’(med) Une laccase (Polyporus pinsitus) E°’(T1) = 790 mV Série de 24 médiateurs , pH 5 ENSEMBLE DES DONNEES P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 ER Kulys et al., JBIC (2000)

LES TRANSFERTS D’ELECTRONS SONT-ILS LIMITANTS DANS LES LACCASES ?  Le paramètre kCAT dépend de E° = E°’(T1) - E°’(médiateur)  Dépendance conforme « en moyenne » à celle attendue pour k (transfert électron)  Grande dispersion par rapport à la moyenne : - Facteur électronique du transfert d’électron ? - Autres facteurs, indépendants du transfert d’électron ? P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

LE FLAVOCYTOCHROME b2 DE Saccharomyces cerevisiae - 190 mV pyruvate FOXHOX cyt red lactate L-lactate pyruvate + 2H+ FRED E1°= - 135 mV FSQ E2°= - 45 mV FOX cyt ox  FOXHRED   FREDHOX e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 EH°- E1° = 130 mV EH °-E2° = 40 mV E°H = - 5 mV FSQHOX    FSQHRED e- cyt red cyt ox + 260 mV cytochrome ox cytochrome red kCAT = 160 s-1 (30°C, pH7) Expériences de saut de température sur formes sauvage et mutées

k2 k1 EH °-E2° k2 MESURE DES CONSTANTES DE VITESSE (16°C)       lactate pyruvate + 2H+ FOXHRED    FREDHOX k2 k1 FSQHOX    FSQHRED P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 kCAT (30°C,pH7) EH °-E2° k2 EH°- E1° k1 Forme sauvage: 160 s-1 40 mV, 170 s-1 130 mV, 1500 s-1 Y143 F : 60 s-1 - 25 mV, 50 s-1 150 mV - Y254 F : 15 s-1 -10 mV, 27 s-1 145 mV - CONCLUSION : transfert d’électron « partiellement limitant » Tegoni et al, Biochemistry (1998)

LES HYDROGENASES A NICKEL-FER - 420 mV Très courtisées actuellement Production de H2 à partir de H2O et énergie solaire. Catalyseur dans biopiles H2/O2 H2 site actif : Ni-Fe - 350 mV 4Fe-4S - 350 mV Étape limitante ? P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 Pourquoi un centre de haut potentiel ? 3Fe-4S + 65 mV Pourquoi un ligand histidine ? 4Fe-4S cytochrome - 300 mV - 350 mV

REMPLACEMENT DU CENTRE 3Fe-4S PAR UN CENTRE 4Fe-4S + 65 mV - 350 mV - 350 mV Forme sauvage N-His cytochrome kCAT = 1050 s-1 4Fe-4S - 250 mV P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 - 380 mV - 380 mV Forme mutée N-His cytochrome kCAT = 366 s-1 CONCLUSION : le centre [3Fe-4S] est « meilleur » ! Rousset et al. PNAS 1998

REMPLACEMENT DU LIGAND HISTIDINE  CYSTEINE - 350 mV - 350 mV + 65 mV Forme sauvage N-His cytochrome kCAT = 1050 s-1 - 350 mV - 350 mV + 65 mV P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 S-Cys Forme mutée cytochrome kCAT  1 s-1 CONCLUSION : le ligand histidine est essentiel !

REMPLACEMENT LIGAND HISTIDINE  GLYCINE - 350 mV - 350 mV + 65 mV Forme sauvage N-His cytochrome kCAT = 1050 s-1 - 350 mV - 350 mV + 65 mV P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06 Forme mutée Gly cytochrome kCAT = 90 s-1 Mais kCAT = 540 s -1 avec 10 mM imidazole ! Confirmation de l’importance du ligand histidine Dementin et al, JACS 2006

CONCLUSION (PROVISOIRE) Hydrogénase: le transfert d’électron est limitant dans les formes mutées Mais dans la forme sauvage ?  L’efficacité d’une chaîne de transfert d’électron ne dépend pas seulement de l’ordre des potentiels rédox des centres Facteur électronique ? A suivre… P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 bertrand@ifr88.cnrs-mrs.fr http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06