Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année 2009-2010

Les réactions antigènes - anticorps : PRESENTATION 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? 2. Quels sont les champs d’application ? 3. Interactions Ag-Ac 4. Quelles techniques utiliser ? II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR 1. Agglutination 2. Précipitation 3. Neutralisation 4. Immunochromatographie III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radio immunologie IV. CONCLUSION

I. PRESENTATION : 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? 2. Quels sont les champs d’application ? 3. Interactions Ag-Ac 4. Quelles techniques utiliser ?

I. 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? Utilisations pratiques : à faire un diagnostic à interpréter le résultat de ce diagnostic à commenter un bilan biologique Utilisations plus fondamentales : préparation de réactifs à usage in vitro ou in vivo compréhension de mécanismes fondamentaux compréhension de pathologies

I. 2. Quels sont les champs d’application ? Identification et/ou dosage d’un Ag : Identification d’une cellule Identification d’un agent infectieux Identification et/ou dosage d’une protéine Dosage d’une hormone Dosage d’un médicament … Mise en évidence et/ou titrage d’un Ac : Diagnostic et suivi sérologique d’une infection Sérologies bactériennes : Fièvretyphoïde, syphilis … Sérologies virales : Hépatites, grippe, rubéole, HIV … Sérologies parasitaires : Toxoplasmose … Contrôle de vaccination Diagnostic et suivi sérologique d’une maladie auto immune Diagnostic sérologique d’une allergie Suivi d’une grossesse Suivi d’une transplantation

I. 3. Interactions Ag/Ac (1/8) : Entre : L’épitope de l’Ag (ou déterminant antigénique) et le paratope de l’Ac (ou régions de complémentarité : CDR) Interaction réversible : Pas de modifications irréversibles de l’Ag ou l’Ac Implique plusieurs interactions, non covalentes : Liaisons faibles par rapport à une liaison covalente : un grand nombre nécessaire Liaisons qui opèrent sur une très courte distance : grande complémentarité : excellente spécificité

I. 3. Interactions Ag/Ac (2/8) : Affinité : Force des interactions entre un seul site de fixation de l’Ag sur un Ac et un seul épitope. Avidité : Résultante des interactions entre les déterminants multiples et répétés d’un antigène et les sites de liaisons multiples d’un anticorps. - Meilleure mesure de la capacité de liaison au sein des systèmes biologiques - Une forte avidité peut compenser une faible affinité (ex : IgM pentamériques vs IgG) Ac polyclonaux vs Ac monoclonaux

I. 3. Interactions Ag/Ac (3/8) : Réaction réversible : loi d’action de masse à l’équilibre : ka [Ag] + [Ac] [Ag - Ac] kd A l’équilibre, selon la loi d’action de masse : [Ag] . [Ac] x ka = [Ag - Ac] x kd [Ag - Ac] ka = = Ka [Ag] [Ag] kd Ka = constante d’affinité (ou d’association)

I. 3. Interactions Ag/Ac (4/8) : LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : [ Ag - Ac] Ka = [Ag ].[Ac] Si : F = [Ag] et B = [Ag - Ac] B F . [Ac] Si : [Ac]T = concentration totale en anticorps F . ([Ac]T - B) = Ka ([Ac]T - B) F = - Ka.B + Ka.[Ac]T

I. 3. Interactions Ag/Ac (5/8) : LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : B/F Ka . [Ac]T Pente = -Ka [Ac]T B

I. 3. Interactions Ag/Ac (6/8) : Conditions physiochimiques : pH :  liaison quand pH  Force ionique :  liaison quand force ionique  Température : en général  de l’affinité avec température (37°C) Réactivité croisée : Si deux Ag différents partagent un épitope identique Si des Ac spécifiques d’un épitope se fixent à un épitope non apparenté possédant des propriétés physicochimiques semblables Rq : souvent observée pour des Ag polysaccharidiques qui contiennent des résidus oligosaccahridiques semblables (Ex :Ag des groupes sanguins ABO)

I. 3. Interactions Ag/Ac (7/8) : Zone d’équivalence / Phénomène de zone Sensibilité / Spécificité - Pour une réaction - Pour l’interprétation d’un résultat Courbes ROC Reproductibilité (CV) / Précision

I. 3. Interactions Ag/Ac (8/8) : Détection et/ou dosage d’Ag : Ag étalons Ac de référence Résultats quantitatifs ou qualitatifs Détection et/ou titrage d’Ac : Pas de sérum étalon Ag de référence Dépistage : résultat qualitatif Titre : résultat semi quantitatif Sérums de calibration Seuil de positivité Différence IgM / IgG Ac d’infection / Ac protecteur

I. 4. Quelles techniques utiliser ? Techniques possibles : Méthodes n’utilisant pas de marqueur : observation directe - Immunoprécipitation - Agglutination - Neutralisation - Immunochromatographie Méthodes utilisant un marqueur : observation indirecte - Radioimmunologie - Immunoenzymologie - Immunofluorescence

II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR : 1. Agglutination 2. Précipitation 3. Neutralisation 4. Immunochromatographie

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (1) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Ag : présent à la surface d’une particule Ac : agglutinines, IgM, liaison multivalente Réseau tridimensionnel Sensibilité : de 0,001 à 0,3 mg/L Lecture : à l’œil Détections / dosages d’Ag Détections / titrages d’Ac

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (2) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Agglutination directe : Ag directement particulaire (bactéries, hématies …) Agglutination passive, indirecte, conditionnée : Un Ag ou un Ac soluble qui est fixé artificiellement sur une particule inerte (latex …) Ac Ag Test négatif Test positif

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (3) :

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (4) : + _

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (5) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Exemples : Groupes sanguins Test de Coombs direct et indirect Sérotypage des bactéries Sérodiagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïde, de la brucellose Sérodiagnostic de la Syphilis : THPA / VDRL …

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (1) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Ag : Soluble Ac : Précipitines, Ig polyclonales Réseau tridimensionnel Lecture : - Néphélémètre - Turbidimètre - Oeil Sensibilité : de 3 à 0,01 mg/L

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (2) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Précipitation en milieu liquide : - Néphélémétrie - Turbidimétrie Précipitation en milieu gélifié : - Immunodiffusion radiale : Mancini - Immunodiffusion double : Ouchterlony Techniques d’identification : - Immunoélectrophorèse - Immunofixation

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (3) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunodiffusion radiale : Technique de Mancini : Plaque de gélose contenant un Ac dans le gel en concentration connue Dépôt de l’Ag à doser dans un puits Diffusion sur plusieurs jours (2-10) Surface du disque généré proportionnelle à la quantité d’Ag Technique simple, mais technique manuelle Dosage assez précis (CV < 10%) Faibles volumes de spécimens ( qq.mL ) Interférences : hémolyse, lactescence Peu adaptée aux grosses molécules (IgM)

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (4) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunodiffusion double : Technique d’Ouchterlony : Disque de gélose Diffusion sur plusieurs jours (~2) Méthode qualitative et comparative Interprétation parfois difficile Quantification approximative

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (5) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Technique de Mancini : Technique d’Ouchterlony :

Technique de Mancini :

Technique d’Ouchterlony :

Technique d’Ouchterlony :

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (6) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Electrosynérèse Dépôt des Ac et Ag en puits Migration à pH 8,0 Migration Ag par électrophorèse Migration Ac par électroendosmose Sensibilité > IDR Nombreux faux positifs Electrophorèse en fusée (EID, Technique de Laurell) Ac mélangé avec gélose à pH 8,6 Migration de l’Ag (~3-4h) Hauteur de l’arc = [Ag] Réfrigérer plaques de migration

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (7) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Piège majeur : EXCES d’ANTIGENE Ac Précipité Immunserums : Cheval : complexes immuns maintenus + longtemps en solution Lapin : limite de détection + basse Zone d’excès d’Ac Zone d’excès d’Ag Anticorps ajouté Zone d’équivalence

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (8) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Excès d’antigène : Solubilisation des complexes Ag-Ac par les Ag libres Même valeur du signal  2 valeurs différentes de la concentration en analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée). Solutions : - 2nde addition d’Ag : pas de rebond du signal - Mesure Vmax et tmax - Aspect des pics d’immunoprécipitation en flux continu

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (9) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunonéphélémétrie : Déviation de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf chimie analytique) Si échantillons dilués : minimisation de la réflexion et l’auto-absorption, mais sources de forte intensité et photodétecteurs sensibles Problèmes : - Excès d’Ag - Diffusion « non immunologique » de la lumière par particules en suspension ou des substances lipidiques - Nécessité d’analyseurs spécialisés

Immunonéphélémétrie : Source lumineuse Échantillon Lumière non déviée Lumière déviée - + Cellule photoélectrique

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunoturbidimétrie : Absorption de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf chimie analytique) Nécessité d’une grande sensibilité des spectrophotomètres Sur des analyseurs de biochimie Problèmes : - Excès d’Ag - Interférences ictère, hémolyse et hyperlipémie

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : IDR EID 48h 3-4h a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications   IDR EID Néphélométrie Turbidimétrie Rapidité 48h 3-4h Quelques minutes Exécution Manuel Automatisé Interprétation Délicate Plus Facile Valeur chiffrée directe mais interférences possibles Sensibilité ~ 1 mg/L EID < IDR Fonction du bruit de fond → 1 µg/L (latex) Précision 8-10% 5% < 5%

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunoélectrophorèse (IEP, Grabar et Williams) Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose Puis double diffusion contre des Ac spécifiques (~48h) Méthode qualitative +++ et comparative Faible coût Quantification approximative Personnel formé et expérimenté Phénomène de zone si excès d’Ag Cercle de précipitation avec cryoglobulines ou IgM polymérisées Technique de référence pour m.e.e Ig monoclonale

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (12) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunofixation : Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose (sur plusieurs pistes) Dépôt d’antisérums monospécifiques, individuellement sur chaque piste de migration Coloration des complexes immuns précipités Dilution du sérum en fonction de la concentration en Ig totalespour limiter effet de zone Interférences analytiques : fibrinogène, lipides / hémolyse Problèmes si cryoglobuline ou IgM polymérisée Rapidité (<2h) et Facilité de lecture (plusieurs Ig MC) Sensibilité > à l’IEP (mais attention aux erreurs par excès)

Immunofixation : IgM Kappa

Immunofixation : IgG et IgA Lambda

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Immunosoustraction : Mise en contact protéines et Ac spécifiques fixés sur billes de sépharose Électrophorèse capillaire de zone (gel de PAA) sur les surnageant Moins sensible que l’IF (pic étroit individualisable) => risque de faux négatifs Automatisée SPE Anti-IgG Anti-Kappa

Personnel expérimenté II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications   IEP IF IS Rapidité ~ 48h < 4h ~ 30min Exécution Personnel expérimenté Simple Automatisable Automatisé Interprétation Subjective Assez facile Facile Sensibilité ++ +++ + Qualitatif Oui Semi -quantitatif Non ± Coût

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (14) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes d’identification f. Applications Dosage des protéines sériques : IgG, IgM, IgA Albumine CRP Haptoglobine … Identification de : Ig monoclonale … Recherche d’Ac : FR ASL

II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (1) : Ag : - enzyme (SLO) - hémagglutinine virale / rubéole, grippe … Ac : - neutralisant - IgA ou autres - protecteur Sensibilité : - environ 1mg/L

+ + + + II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) : Application : Détection et titrage d’Ac anti Streptolysine O (ASLO) (Cf bactériologie) (http://stl_bjb.ac-dijon.fr/biohum/bhaslo.htm) Action de la SLO sur les hématies : Lyse des hématies L’hémoglobine intra-érythrocytaire est rejetée dans le milieu SLO Hématies + Détection des ASLO par neutralisation : Sérum qui contient des ASLO + Pas de lyse des hématies, les SLO sont neutralisées Lyse des hématies + NEUTRALISATION Sérum qui ne contient pas d’ASLO + Pas de neutralisation

II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) : Puis dilutions successives du serum pour titrage des ASLO :

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (1) : Test de Détection Rapide Technique sandwich Recherche d’Ag : - Streptocoque du groupe A - Détection de toxines bactériennes - Recherche de Plasmodium - Recherche de médicaments - Détection d’hormone - … Recherche d’Ac : - Syphilis - Maladie de Lyme - Maladie coeliaque - Ac anti tétanique

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Ac fixé Ag fixé migration dépôt Si Ac+ Contrôle migration C Ag conjugué à particules d’or ou coloré C C Ac (sérum) ?

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Ag fixé Ac fixé migration dépôt Si Ac- Contrôle migration C Ag conjugué à particules d’or ou coloré C C Ac (sérum) ?

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Ad fixé Ac fixé migration dépôt Si Ag+ Contrôle migration C Ac conjugué à particules d’or C C Ag (sérum) ?

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Ag fixé Ac fixé migration dépôt Si Ag - Contrôle migration C Ac conjugué à particules d’or C C Ag (sérum) ?

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Nég Pos Ininter-prétable

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Réaction Ag-Ac avec Ag ou Ac marqué par un traceur Différenciation traceur libre / traceur lié ([Ag-Ac]) - Signal mesuré après séparation (phase hétérogène) - Modification du signal (phase homogène) Nombreuses techniques en fonction - de la nature du traceur (isotopique, enzymatique, luminescent, fluorescent) - du procédé : indirect, compétitif ou sandwich

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé sandwich : (IRMA, IEMA, IFMA, ICMA) En excès d’Ac Réaction totale Signal croissant avec la concentration d’Ag à doser Signal fraction liée S S E E E E Lavage Lavage Lavage Puits avec l’Ac adsorbé Ajout de l’Ag à doser Ajout de l’Ac secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de l’enzyme et mesure de l’intensité de coloration [Ag] Avantages : - Sensibilité, précision , spécificité et domaine de mesure +++ - Praticabilité accrue Mais : - Seulement pour les Ag de MM élevée (2 sites antigéniques) - Effet crochet pour les concentrations élevées - Superspécificité, Ac hétérophiles (anti-Ig animales du réactif)

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Effet crochet : Chute paradoxale du signal mesuré en présence d'une forte concentration de l'Ag à doser et obtention d'une courbe en cloche. Même valeur du signal  2 valeurs différentes de la concentration en analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée). Solution : diluer E E E E

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé compétitif : (RIA, EIA, FIA, CLIA) En défaut d’Ac Réaction à l’équilibre Signal décroissant avec la concentration d’Ag à doser Signal fraction liée S E E Incubation de l ’Ac avec l’Ag à doser Lavage Lavage Placer le mélange Ag-Ac dans un puits avec l’Ag adsorbé Ajout de l’Ac secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de l’enzyme et mesure de l’intensité de coloration [Ag] Avantages : - Pour tous les Ag (même les haptènes) - Phase homogène possible (FPIA, EMIT) Mais : - Domaine de mesure restreint - Mauvaise précision, spécificité moindre, moins praticable

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé indirect : (IF, ELISA) Signal croissant avec la concentration d’Ac à doser Signal fraction liée S S E E E E Lavage Lavage Lavage Puits avec l’Ag adsorbé Ajout de l’As spécifique à doser Ajout de l’Ac secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de l’enzyme et mesure de l’intensité de coloration [Ac] Avantages : - Etude des classes et sous classes des Ac Mais : - Problème d’expression des résultats

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie   Traceur Avantages Inconvénients Radioactif 3H, 125I, 57Co - Faible encombrement stérique Signal d’émission direct, spontané et spécifique Précision, LD basses - Législation Gestion des risques, déchets, commandes Peut être automatisée Enzymatique HRP, PAL, G6PD - Pas d’appareillage spécialisé - Simplicité du marquage - LD moins bonnes - Très dépendant des conditions opératoires - Faible dynamique du signal - Automatisable

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie   Traceur Avantages Inconvénients Fluorescent Fluorescéine 4MUP£ Chélates de lanthanides (Eu) - Facilité de marquage Stabilité du traceur Précision, LD basses - Quenching - Conventionnels : *LD peu favorables *Interférences *Faible dynamique du signal Luminescent Luminol Esters acridium Dioxétanes Sels de Ru - Stabilité du traceur Signal très spécifique Acquisition rapide et grande dynamique du signal Signal fugace Appareillage spécialisé Rq : 4MUP : 4 methyl umbelliferyl phosphate

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel une enzyme a été fixée Marqueurs : - Phosphatase alcaline, peroxydase - Ag ou Ac marqué par une enzyme Révélation par un : - Substrat chromogène : spectrophotomètre - Substrat luminogène : chimiluminescence Phase hétérogène Sensibilité : environ 0,00001 mg/L Résultats qualitatifs, semi quantitatifs ou quantitatifs

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Méthodologies : ELISA indirect ELISA compétitif ELISA sandwich Chimioluminescence Techniques dérivées : - Western Blot - ELISPOT - Immuno peroxydase

ELISA par compétition Recherche d’un Ac III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie ELISA par compétition Recherche d’un Ac P Ac marqués à la phosphatase alcaline Ac à doser P P signal Lecture spectrophotométrique [Ac] à doser

ELISA indirect Recherche d’un Ac III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie ELISA indirect Recherche d’un Ac Révélation substrat chromogène Ag fixé sur le support (cupule) Ac recherché Ac anti Ig totales ou de classe marqué par une enzyme E E E E

ELISA sandwich Recherche d’un Ag III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie ELISA sandwich Recherche d’un Ag Révélation substrat chromogène Ac spécifiques de l’Ag recherché Ag recherché Ac anti Ig marqués par une enzyme E E E

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Technique dérivée : Immunotransfert = immuno-empreinte = Western Blot : Séparation par électrophorèse sur gel de PAA (+ résolutif) Transfert sur une membrane (de nitrocellulose, par exemple) Dépôt d'un Ac spécifique, suivi d'un second Ac marqué par une enzyme Pour l’analyse et l’identification des Ac Technique longue Sensibilité +++ (20 µg/mL) Faible coût, interprétation facile

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Western Blot PM P P P P P P Ag fixés sur le support Ac recherchés Ac de chèvre anti IgG marqués à la phosphatase alcaline P P P P P P P

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Western Blot HIV1

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Ac anti histones

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Ac Anti ribosomes

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Technique dérivée : ELISPOT Dénombrement au sein d’une suspension hétérogène des cellules sécrétant des Ac spécifiques ou des cytokines. Sensibilité +++ (10-5) Spot = emplacement de la cellule sécrétrice S NS Ajout de la population de cellules à tester S NS Elimination des cellules et Lavage Ajout de l’Ac anti-cytokine conjugué à un enzyme S Ajout du substrat de l’enzyme et dénombrement des spots E Puits avec l’Ac anti-cytokine adsorbé Puits vu de dessus

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Technique dérivée : ELISPOT

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Technique dérivée : Immunopéroxydase 1 : Ag ? 2 : Ac spécifique 3 : Anti Ig 4 : Avidine-biotine-peroxydase

Ag : Ac : III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Applications de l’ELISA : Ag : Recherche d’Ag bactériens, viraux fongiques, parasitaires Dosages hormonaux Dosages de médicaments … Ac : Auto immunité Sérologies bactériennes Sérologies virales Sérologies parasitaires IgE spécifiques …

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie IF : IMMUNOFLUORESCENCE : Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel un produit fluorescent a été fixé Marqueurs : - fluorescéine, rhodamine, phycoérythrine - Ag ou Ac marqué par un produit fluorescent Phase hétérogène Révélation au microscope à fluorescence Utilisation de banques d’images Sensibilité : environ 0,1 mg/L Résultats qualitatifs ou semi quantitatifs

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie IF : IMMUNOFLUORESCENCE : IF directe : détection d’Ag surtout IF indirecte : détection d’Ac surtout - Ac anti isotype - Protéine A IF sandwich Techniques dérivées : Cytométrie en flux = FACS Technique Multiplex Microscopie confocale

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Cytométrie en Flux = CMF Numération des cellules exprimant un Ag au sein d’une suspension hétérogène Ac monoclonaux conjugués à des fluorochromes Analyse multiparamétrique : taille (petits angles) granulosité (à 90°) intensité de fluorescence de plusieurs fluorochromes différents / seuil de positivité Plusieurs milliers de cellules en quelques secondes

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Cytométrie en Flux / Principes Laser Photodiode Suspension cellulaire Liquide de gaine PMT 2 PMT 1 PMT 3 Filtres dichroïques Taille (FSC) Granulosité (SSC) Filtres Lentille Poubelle Tube collecteur 1 Tube collecteur 2 Plaque + Plaque -

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Cytométrie en Flux

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Cytométrie en Flux / Expression des résultats Ly T CD8- Ly T CD8+ Cytogramme en 2 dimensions Sélection d’une population à analyser Ly CD8+ CD3-

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Cytométrie en Flux Histogramme Histogramme avec superposition d’un marquage spécifique et anticorps de contrôle (irrelevant)

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Technique Multiplex Principe : Combinaison d’une détection de fluorescence en cytométrie sur des billes spécifiques d’un analyte. Utilisation de différentes billes, repérables chacune par leur intensité de fluorescence rouge et orange. Pour chaque type de bille on réalise un immunodosage en fluorescence d’un analyte. Incubation du milieu avec le mélange de billes Lavage, incubation avec le système de révélation Passage des billes sur un « cytomètre » spécifique

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie RIA = RADIO IMMUNOASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur le quel un radio-isotope a été fixé Marqueurs : 125 I,3H Ag ou Ac marqué par un radio-isotope Révélation par comptage Sensibilité: environ 0,00001 mg/L Phase hétérogène Résultats quantitatifs

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Méthodologies : RIA indirect : Ac Ac anti isotype Protéine A RIA compétitif : Ag et Ac RIA sandwich : Ag et Ac

IV. CONCLUSIONS : Nombreuses techniques possibles : Pièges Limites Avantages Choix de la technique en fonction de : Sensibilité Spécificité Matériel dont on dispose Prix de revient Nombre de tests Automatisation ou coup par coup Temps Nature du prélèvement Ag ou Ac Classe des Ig Rendu du résultat : qualitatif, quantitatif ou semi quantitatif …