Génétique bactérienne Pr BENMAHDI.L

Plan Le génome bactérien Variations génétiques Eléments constitutifs du génome: L’ADN Chromosomique : Le gène bactérien Séquence des génomes bactériens Réplication de l’ADN bactérien Expression, régulation des gènes bactérien L’ADN extra-chromosomique - Les plasmides -Transposons Cassettes Intégrons Variations génétiques Modifications (mutations, remaniements intra-génomiques) Acquisition d’ADN exogène

Le génome bactérien: un modèle d’étude de la génétique du vivant. Structure simple et parfaitement connue Temps de génération des bactéries court Génétique bactérienne à l’origine : Des grandes découvertes de génétique De la génétique moléculaire Les manipulations génétiques

L’ADN bactérien Chromosome Plasmide Localisations

Acide DésoxyriboNucléique Crick et Watson, 1953 Découverte de la structure de la molécule d'ADN Acide DésoxyriboNucléique Watson et Crick ADN = polymère de nucléotides

Structure des acides nucléiques : DNA= acide désoxyribonucléique: est le matériel génétiques de toutes les cellules vivantes (sauf certains virus ,ont comme matériel génétiques l’ARN ). -Nucléotide = phosphate + sucre + base azotée -ribose -Adénine -2.Désoxy- -guanine ribose -cytosine -thymine ou uracile Synthèse du DNA =réplication :5’---3’ (DNA polymérase ) réplication semi- conservative Synthèse du RNAm : transcription , 3’--- 5’ ( RNA polymérase ) Synthèse des protéines :est le processus par lequel l’information génétique s’ exprime.

NUCLÉOTIDE Base azotée Groupement phosphate Sucre : désoxyribose

Donc quatre sortes de nucléotides: A, T, C et G Les nucléotides peuvent se lier les uns aux autres par leur sucre (désoxyribose) et leur groupement phosphate.

Hypothèse de Crick et Watson : A peut s'apparier avec T et C avec G : A avec T : deux liaisons hydrogène (liaisons faibles). C avec G : trois liaisons hydrogène

Dans une bactérie : 1 seule molécule d'ADN ~ 5000 paires de bases 5 millions de paires de base. Longueur totale ~ 1,5 mm Bactérie E. coli "éclatée". L'ADN s'est répandu autour de la bactérie.

Dans une cellule humaine : 46 molécules d'ADN Chaque molécule d'ADN s'enroule sur des protéines (histones) et forme un chromosome. ADN Un chromosome = une molécule d'ADN et les protéines sur lesquelles elle s'enroule. Histones L'ensemble des chromosomes forme la chromatine

L’ADN bactérien Structure primaire De l’ADN Structure secondaire Liaison etheroxyde Structure primaire De l’ADN Structure secondaire De l’ADN

Le chromosome bactérien Filament d’ADN bicaténaire Circulaire Unique Surenroulé Chromosome d’E. coli marqué au tritium

Gènes et chromosomes Un segment d'ADN portant toute l'information nécessaire pour la synthèse d'une protéine = gène Ex. gène du lysozyme ; gène du B -lactamase gène de l'anhydrase carbonique gène du collagène Gène de la protéine Phé-Arg-Leu-Phé-Leu

Le gène bactérien Codon d’initiation Codon stop Promeut la transcription Code la séquence de fixation à l’ARNr Code la séquence peptidique Code le relargage de l’ARN pol. Partie non transcrite

Ultrastructure réplicative « theta » Réplication bidirectionnelle Origine de réplication (ori) Site de terminaison (ter)

La fourche de réplication Fragment d’Okasaki 5' 3' 3' 5' 5' 3' Ouverture de la double hélice Synthèse 3’  5’ ADN polymérases

Transcription et traduction d’un gène bactérien Codon d’initiation (AUG) ARNm Leader peptide

Régulation du fonctionnement des gènes bactériens Opérateur (lacO) Régulateur Promoteur (lacP) Perméase Opérons = plusieurs gènes, 1 seul promoteur Régulons = ensemble de gènes ou opérons co-régulés par un gène régulateur ex: opéron lactose lacI lacZ lacY lacA ß-galactosidase Liaison à lacO et blocage de l’ARN pol Transacétylase Répresseur ß-galactoside Complexe le répresseur

Eléments génétiques mobiles :L’ADN extra-chromosomique Plasmides Cassettes Intégrons Transposons

Plasmides Eléments facultatifs ADN bicaténaire circulaire 1% de la taille du chromosome Autoréplicatifs (réplicons) Plusieurs plasmides identiques ou différents par cellule Transmis à la descendance Stables si avantage sélectif Autotransférables d’une cellule à l’autre (gènes de transfert) même interspécifique non indispensables au métabolisme normal de cellule-hôte. Leur transmission d'une cellule bactérienne à une autre peut s'effectuer par conjugaison ou transduction

Mise en évidence Le terme de plasmide a été créé en 1952 par Lederberg pour désigner tout élément génétique cytoplasmique, comme le facteur F. Les plasmides de résistance aux antibiotiques ont été découverts en 1956 au Japon à l'occasion d'une épidémie de dysenterie bacillaire (Shigella dysenteriae) à bacilles résistants.

Propriétés biologiques portées par les plasmides Les gènes portés par les plasmides peuvent coder pour la synthèse de protéines qui confèrent des propriétés biologiques diverses : résistance aux antibiotiques  ; résistance aux antiseptiques mercuriels, aux métaux lourds et aux bactériophages. La virulence des bactéries peut aussi être à médiation plasmique : pouvoir pathogène des colibacilles entéropathogènes (diarrhées des voyageurs), pouvoir pathogène des staphylocoques dans l'impétigo (exfoliatine). Les plasmides peuvent également coder pour la synthèse de bactériocines

Les plasmides confèrent aux bactéries qui les hébergent de nombreux caractères génétiques par un mécanisme d'addition et non par un mécanisme de substitution. Ils représentent un élément essentiel d'adaptation bactérienne. Ils sont responsables d'épidémies de gènes (notamment de résistance aux antibiotiques), qui ont fait découvrir les transposons ( en 1971 par N Datta) , appelés encore gènes sauteurs ou mobiles.

Un plasmide de polyrésistance aux antibiotiques Fonctions de résistance (2 transposons emboîtés) Tn3 Isl Km Fonctions de réplication Ap Tn4 Sm, Su Cm Gènes de résistances Is1 Fonctions de transfert (RTF)

Transposons 500 à 10000 PB mobiles (transposition) insertion sans homologie Génes différents Séquences Autres gènes d’insertion 3 intégrons (700 à 2000 PB) Séquences répétitives inversées (15 - 25 PB) Géne de la transposase (enzyme reconnaissant les sites d’insertion) CGCT AGCG GCGA TCGC IRD IRG

La transposition C’est l'intégration directe d'une séquence de gènes (de taille limitée) au sein d'un génome (chromosomique ou plasmidique), en l'absence d'homologie de séquence nucléotique (recombinaison illégitime). Les gènes qui s'additionnent de cette manière sont dits transposables et s'organisent en structures appelées transposons(Tn) qui portent les déterminants de la transposition (excision, intégration, transposition) et des gènes qui codent pour d'autres fonctions (exemple la résistance aux antibiotiques ).

Mouvements des transposons

Cassettes Eléments génétiques mobiles Constitution: Intégration et excision médiés par une intégrase externe Constitution: Ensemble de gènes co-transcris (souvent résistance à un ATB) Site de reconnaissance d’une intégrase Non auto réplicatifs, non autotransférable, sans promoteur (donc non transcrits isolément)

Structure des cassettes

Intégrons Systèmes de capture et d’expression de cassettes Structure: Souvent des cassettes de résistance aux AB Structure: Région 5’ Gène d’ntegrase (intI) site d’attachement (att) Promoteurs (P1 P2…) pour toutes les cassettes (les plus proches sont les mieux transcrites) Région 3’ Cassettes de résistance Mobiles (cibles d’intégrations multiples) Non auto réplicatif, non autotransférable

Constitution d’un intégron à 2 cassettes Promoteur site spécifique de recombinaison attC reconnu par l'intégrase Intégrase

EXP:2 intégrons décrits chez les entérobactéries 3’ 5’ Gène de l’intégrase Site d’intégration Cassettes de résistance

La carte génomique de E. coli

Variations génétiques: Modifications (mutations, remaniements intra-génomiques). Acquisition d’ADN exogène

Variations génomiques chez les bactéries Variations phénotypiques: (Modification de l’expression du génome) Adaptation Réversible si l’environnement change Non transmissible Exemple: expression d’une b-galactosidase Variations génotypiques: (Modification de la structure du génome) Non réversible Transmissible Exemple: mutations, remaniements, acquisition d’ADN exogène

Adaptations phénotypiques Adaptation de E.coli au substrat énergétique du milieu Variation S/R des colonies de pneumocoque

Variations génotypiques Acquisition de multirésistance aux antiseptiques et antibiotiques

1/- Mutations: nature et définitions Modifications accidentelles de la séquence de l’ADN Survenant lors de la réplication Exemples: Délétion ou insertion  décalage du cadre de lecture Substitution d’un nucléotide  modification du message Mutation silencieuse (acide aminé identique ou équivalent) Mutation létale (produit du gène essentiel) Mutation non sens (codon stop) Mutation faux sens (substitution d’un AA) Protéine plus ou moins fonctionnelle

Mutations: caractères 1 Rares : taux de mutation = 10-5 à 10-9 Augmenté par les agents mutagènes 2 Spontanées les antibiotiques n’induisent pas de mutation 3 Stables Mutations reverses Mutations compensatoires 4 transmises à la descendance 5 Indépendantes et spécifiques autres caractères intacts taux de mutation pour 2 caractères = produit des taux de mutation

Rareté des mutations Mutation Sélection Population SmR Population SmS 4 # 10 cellules Gélose + Sm 8 # 10 cellules 4 10 cellules Population SmS Mutation Sélection Population SmR

Spontanéité des mutations Expérience de Lederberg Répliques Spontanéité des mutations Expérience de Lederberg Pas de Sm Sm 108 cell. 1°- Les variations génétiques ont lieu au hasard en l’absence de l’agent sélecteur. 2°- L’antibiotique sélectionne les variants les mieux adaptés 105 cell. culture 102 cell. culture 0,1 ml 0,1 ml suspension culture culture confluente confluente

Indépendance des mutations INH : TM=10-6 Rifampicine: TM= 10-7 Culture stérile TM =10-13

2/-Remaniements intra-génomiques Déplacement de transposons ou de séquences d’insertion Insertion de phages

A SUIVRE…

Génétique bactérienne Le génome bactérien Eléments constitutifs du génome: Chromosome et ADN extra-chromosomique Le gène bactérien Les éléments mobiles Cassettes Intégrons Transposons Les plasmides Séquence des génomes bactériens Réplication de l’ADN bactérien Expression, régulation des gènes bactériens Variations génétiques Modifications (mutations, remaniements intra-génomiques) Acquisition d’ADN exogène

Acquisition d’ADN exogène Cellules donatrices Réplication Lyse Cellule recombinante Exogénotes Exogénote Endogénote cellule réceptrice 1°- Transfert 2°- Recombinaison

Transformation: expérience de Griffith (1928) Du matériel provenant d’une bactérie morte peut transmettre la virulence. 1944: Avery montre qu’il s’agit d’ADN

La transformation en pratique Phénomène fréquent chez certaines espèces Transferts interspécifiques possibles Caractères de résistance, de virulence ou métaboliques Pneumocoques résistants aux b-lactamines Technique de base en biologie moléculaire

Caractéristiques de la transformation Le DNA doit être libéré d’ une bactérie (exogénote ) Le DNA nu doit se fixer sur une bactérie réceptrice en phase de compétence L’ absorption d’ADN polymérisé est suivie d’ une recombinaison légitime avec acquisition de nouveaux caractères génétiques stables, transmissibles à la descendance ( recombinants ou transformants ) Le transfert est partiel :une partie de l’exogènote ( 1-2% du génome) pénètre et se recombine ( si homologie suffisante) Ce transfert naturel d’ ADN bactérien est limite à quelques espèces telles streptococcus dont S.pneumoniae, Neisseria ,Haemophilus ……..

LES PRINCIPALES ETAPES DE LA TRANSFORMATION NATURELLE L’ADN/: bicaténaire, d’origine variable 1ère étape: fixation covalente à un complexe protéique membranaire 2ème étape: fragmentation de l’ ADN ( nucléase) 3ème étape : entrée de l’ ADN simple brin dans la bactérie 4ème étape : devenir de l’ ADN simple brin transformant dans la bactérie recombinaison homologue nécessitant de large homologies entre l’ADN exogène et endogène, avec remplacement allélique. l’ADN provient de la même espèce bactérienne ou d’une espèce proche

Mécanisme de la transformation ADN transformant Bactérie « compétente » Nucléotides 1. Fixation de l ’ADN à la surface 2. Action d ’une nucléase 3. Association à une protéine de compétence 4. Intégration d’un brin dans le chromosome de l’hôte

Applications scientifiques un grand intérêt historique : L'ADN est bien le support chimique de l'héridité, et non les protéines. Il a permis l'établissement des premières cartes génétiques partielles chez les bactéries, et donc des études plus précises sur la virulence, la résistance aux antibiotiques........ C'est une technique de base du génie génétique, utilisée quotidiennement dans les laboratoires lors de clonage. En bactériologie médicale: Son intérêt est lié à l'émergence d'espèces résistantes aux antibiotiques comme le pneumocoque ou récemment, le méningocoque

Conjugaison ou sexualité des bactéries Définition Processus sexuel nécessitant un appariement entre bactéries de sexes différents et formation d’un pont cytoplasmique permettant les échanges génétiques:un transfert unidirectionnel d’ADN d’une cellule donatrice (f+) à une cellule réceptrice (f-), par un mécanisme requérant un contact spécifique. Le facteur de sexualité ou de fertilité (F) permet la synthèse de pili sexuels chez la bactérie donatrice ou mâle et donne la polarité au chromosome. Le transfert d’ADN chromosomique est à sens unique, orienté, progressif et parfois total (2h). Le transfert d’ADN chromosomique est spécifique (intra-espèces) et limité à certaines espèces à Gram négatif telles E.coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus. Le transfert d’ADN plasmidique et de transposons est très fréquent et peu spécifique (inter-espèces)

Conjugaison: Lederberg et Tatum (1946)

Conjugaison: Lederberg et Tatum (1946)

Le facteur de fertilité: le plasmide F+, premier plasmide connu Le plasmide F+: DNA circulaire double brin,~ 2% du chromosome bactérien. Le plasmide F+ se réplique chez E.coli et Salmonella typhimurium. Le plasmide F+ code pour des fonctions de transfert (région tra de 30 kb de ~ 30 gènes), incluant la biosyntheses de pili sexuels. Le plasmide F+ peut s’insérer dans le chromosome (bactéries HFr High Frequency recombination) et mobiliser le transfert partiel des gènes chromosomiques du donneur dans la bactérie réceptrice (F-).

Mécanisme de la conjugaison Facteur F (fertilité) Recombinaison Bactérie réceptrice (femelle) Bactérie donatrice (mâle) Pili sexuel

F+ Hfr

Conséquences de la conjugaison La caractérisation des propriétés remarquables du facteur F: ( plasmide F = insertion au chromosome en des sites limités ou autonome).le passage de l’état intégré à l’autre par excision peut entrainer la formation d’un plasmide F’ (unité autonome de réplication et porteuse de gènes bactériens). La sex-duction ou F duction se définit par le transfert de F' à une nouvelle cellule réceptrice (F-), suivi ou non de recombinaison légitime . L’établissement de cartes génétiques du chromosome bactérien (E.coli). La circularité du chromosome bactérien. Principal facteur d’évolution des bactéries: acquisition de plasmides de résistance aux antibiotiques, et porteurs de gènes de virulence et métaboliques.

Les différentes modalités de croisement sont les suivantes F+ X F-, le facteur F est transmis à haute fréquence, la bactérie réceptrice devient F+, mais aucun gène chromosomique n'est transmis. Hfr X F-, le facteur F n'est que rarement transmis à la bactérie réceptrice qui reste F-. En revanche, des gènes chromosomiques sont transmis à haute fréquence. observé chez des bactéries à Gram négatif (entérobactéries, Pseudomonas spp.) = transconjugant ( F-)

F+ X F-

Hfr x F-

F' X F- : le facteur F' est transmis à haute fréquence, la bactérie réceptrice devient F' et elle acquiert un ou quelques gènes de la bactérie donatrice. Si les génomes des bactéries donatrices et réceptrices présentent de fortes homologies, le gène (ou les gènes) acquis peut (ou peuvent) s'intégrer dans le chromosome de la bactérie réceptrice (recombinaison légitime)= bactérie Hfr Dans le cas contraire, il ne s'intègre pas et il devient un gène transmissible à haute fréquence = bactérie F'

Transferts par conjugaison + Transfert du facteur F seul F+ + F- 2 F + 10 -8 10 -5 + Sexduction F- F+ HFr F’ Transfert de marqueurs chromosomiques + HFr + F- HFr + transconjugant

La transduction Définition: Transfert d’ADN bactérien d’une bactérie à une autre par l’intermédiaire d’un bactériophage. ce transfert partiel de gènes bactériens peut s’accompagner d’une recombinaison légitime : Transduction généralisée: le phage emporte n’importe quel gène de la bactérie donatrice. Transduction abortive: (pas d’intégration) . Transduction spécialisée: le DNA phagique s’intègre toujours au même endroit.

Caractéristiques de la transduction Bactériophages: vecteurs de transduction. Particules transductrices: les phages virulentes contenant de l’ADN bactérien encapsidé . Processus essentiellement intra-spécifique Deux types de transduction : la transduction généralisée. la transduction spécialisée. L’existence de nombreuses souches lysogènes fait qu’il s’agit d’un phénomène général chez les espèces Gram positif (Staphylocoques, Bacillus) et Gram négatif (Entérobactéries, Pseudomonas).

Efficacité du phénomène Protection du DNA dans les particules virales. Système de délivrance très performant Abondance des phages en milieu aquatique 103 et 108 phages/ ml. ( 108 phages/ ml ≈ 1/3 population bactérienne sujette à une attaque virale/ 24 h)

Les bactériophages Virus des bactéries Infection soit par : Phage virulent  cycle lytique Phage tempéré  Intégration au chromosome (prophage inductible, bactérie lysogène)

Conséquences de la transduction Mode de transfert ayant un intérêt historique (phage lambda de E. coli). Transfert en ADN bactérien ou plasmidique limité (taille du phage) (< 50 kb) En bactériologie médicale: on évoquera le terme de conversion lysogénique qui pourrait être une autre modalité de transduction

La conversion lysogénique Définition: C'est l'acquisition par une bactérie d'un caractère somatique particulier déterminé par le génome d'un prophage spécifique. Son expression dans toutes les bactéries est lié à l'état lysogène. Il disparait avec la perte de celui-ci. Exemples: - Toxine du bacille diphtérique et phage β - Certains facteurs antigéniques de Salmonella (conversion lysogénique) Certains « ilots de pathogénicité » des bactéries sont en fait hébergés par des prophages intégrés dans les chromosomes bactériens (V. cholerae, E.coli EPEC e t EHEC,…)

Régulation des variations génétiques Systèmes de réparation des mutations Systèmes de réparation des mésappariements Systèmes SOS, Rec … Les souches hypermutatrices  évolution rapide Systèmes de restriction / méthylation Restriction des recombinaisons par les endonucléases de restriction Protection de l’ADN par les enzymes de méthylation recombinaisons seulement entre bactéries taxonomiquement proches

Applications de la génétique bactérienne 1.Technique de Dtic par biologie moleculaires ( PCR, séquençage , hybridation ……etc ) 2. Phagothérapie contre bactéries multirésistantes (BMR): utilisation des bactériophages dans le traitement des infections bactériennes , des pistes alternatives à l’antibiothérapie des infections bactériennes (pulmonaires, cutanées, digestives) sont traitées par bactériophages (phagothérapie) en Géorgie, en Pologne et en Russie. En Europe, les bactériophages n’ont pas pour l’instant de statut spécifique

Conclusions Génome des bactéries très plastique Variations / sélections = source de diversité +++  adaptation, évolution Une semaine de bactérie = 10 000 ans humains

FIN