Introduction aux techniques de biologie moléculaire Cours M1 - 2012 Introduction aux techniques de biologie moléculaire Partie 2

Extraction des protéines Western-blot Extraction des protéines Echantillon d’origine:  Tissu (foie, cœur, etc…)  Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires) Extraction des protéines: Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases - Tris-HCl Séparation fraction/extraits totaux - Centrifugation - Ultracentrifugation Débris cellulaires Surnageant = Protéines

Dosage des protéines - Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry: Western-blot Dosage des protéines - Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry: Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+ Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm Peu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite - Méthode de Bradford: Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe) Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm) Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents Méthode BCA Acide bicinchonique Formation complexe coloré avec Cu+ Couleur violette, pic abs à 562 nm Très sensible, rapide, compatible avec les détergents Réduction Cu2+ par cystéine, cystine, tyr et trp 5

Dosage des protéines: exemple Western-blot Dosage des protéines: exemple Solution d’Albumine bovine à 1 mg/mL Dilution en séries Echantillon à doser Distribution Mesure au spectrophotomètre Concentration DO Droite étalonnage DO échantillon Conc échantillon

Dépôt et migration des échantillons Gel SDS-page Western-blot Dépôt et migration des échantillons Gel SDS-page Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Gel de concentration (pH 6,8) 5% acrylamide) Gel de séparation (pH 8,8) 5-15% acrylamide Sens de migration + pourcentage est élevé + densité réseau est élevée + mailles sont serrées

Dépôt et migration des échantillons Western-blot Dépôt et migration des échantillons Solution de dépôt: - Tampon HCl pH 6,8  Idem gel de concentration Bleu de bromophénol  Suivi de la migration Glycérol  Densifier l’échantillon Séparation selon le poids moléculaire des protéines

Coloration du gel Contrôle de l’homogénéité de la migration Western-blot Coloration du gel Contrôle de l’homogénéité de la migration Vérification de la présence de protéines Bleu de Coomassie (coloration homogène) Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)

Transfert sur membrane Western-blot Transfert sur membrane - Pression, application d’un courant Fixation des protéines de façon non-spécifique: - Interactions ioniques - Interaction hydrophobes - Membranes nitrocellulose / PVDF

Coloration de la membrane Western-blot Coloration de la membrane Contrôle de l’efficacité du transfert Contrôle de l’homogénéité des dépôts Coloration réversible

Immunocytochimie Les fluorochromes Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption - un spectre d’émission Ex: Fluorescéine Absorption des radiations bleues (max 490 nm) Émission d’une fluorescence verte (max 520 nm)

Les fluorochromes Diagramme de Jablonski S1 État excité Immunocytochimie Les fluorochromes Diagramme de Jablonski S1 Emission État excité Niveau d’énergie des électrons d’une molécule fluorescente Fluorescence S0 État fondamental Laser Absorption

Étude des facteurs de transcription Gel retard Étude des facteurs de transcription Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Facteur de transcription activé Recrutement du complexe d’activation de la transcription ADN Séquence de fixation spécifique TATA box Gène Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible

Gel retard Principe (1) Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.  Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.  Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la forme radioactive.  Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard plus important sur le gel appelé " supershift ".

Principe (2) + * * * * * Gel retard Sondes spécifiques marquées au P32 Protéines nucléaires extraites * - Fixation de la protéine sur sa séquence cible - Élimination des autres * Sonde libre * Sonde + protéine + Ac = « Super-Shift » Dépôt sur un gel natif * Sonde + protéine

Résultats Extraits nucléaires de cellules Hela Gel retard Résultats Extraits nucléaires de cellules Hela Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires - Manipulation de la radioactivité

Le microscope à fluorescence Immunocytochimie Le microscope à fluorescence Filtre correspondant au fluorochrome utilisé Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine: 490 nm) Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par transmission que les radiations vertes (fluorescéine: > 500 nm) Filtre d’émission (6): ne laisse passer par transmission que les radiations vertes 1-lampe à arc 2-filtre d'excitation 3-miroir dichroïque 4-objectif 5-préparation 6-filtre d'émission 7-oculaire

Le microscope à fluorescence Ex: Fluorescéine Immunocytochimie Le microscope à fluorescence Ex: Fluorescéine Le filtre d'excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome... ...qui sont réfléchies par le miroir et éclairent l'échantillon... ...celui-ci émet les radiations de fluorescence qui seules atteignent l'oculaire.

small interfering RNA (siRNA) ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine Mécanisme très spécifique Permet l’étude des gènes Les ARN double brins présents dans une cellule sont tout d'abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l'« éminceuse ». Celle-ci clive l'ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les siRNA à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Un des brins du siRNA, dit passager, est éliminé tandis que l'autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le siRNA et l'ARNm cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et n'est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage. Ce mécanisme est donc très spécifique de la séquence du siRNA et de sa cible, l'ARNm. Dans certains cas, on peut choisir un siRNA capable de cliver un ARNm porteur d'une mutation ponctuelle sans affecter l'ARNm sauvage.

ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA) RNA interférence ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA) DICER Ribonucléase qui clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 pb Complexe RISC (RNA-Induced Silencer Complex) DICER Clivage de l’ARNm cible par RISC Les ARN double brins présents dans une cellule sont tout d'abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l'« éminceuse ». Celle-ci clive l'ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les siRNA à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Un des brins du siRNA, dit passager, est éliminé tandis que l'autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le siRNA et l'ARNm cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et n'est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage. Ce mécanisme est donc très spécifique de la séquence du siRNA et de sa cible, l'ARNm. Dans certains cas, on peut choisir un siRNA capable de cliver un ARNm porteur d'une mutation ponctuelle sans affecter l'ARNm sauvage. Elimination d’un des brins du siSNA, dit « passager » Ciblage des ARNm de la cellule possédant une séquence complémentaire

siRNA RNA interférence Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible  Mécanisme très spécifique Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine Les ARN double brins présents dans une cellule sont tout d'abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l'« éminceuse ». Celle-ci clive l'ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les siRNA à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Un des brins du siRNA, dit passager, est éliminé tandis que l'autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le siRNA et l'ARNm cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et n'est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage. Ce mécanisme est donc très spécifique de la séquence du siRNA et de sa cible, l'ARNm. Dans certains cas, on peut choisir un siRNA capable de cliver un ARNm porteur d'une mutation ponctuelle sans affecter l'ARNm sauvage. Frede et al., 2005 Anand et al., 2007

Extraction d’ARN Molécules très fragiles - Matériels stérile, RNAses et DNAses free - Travail sur glace - Port de gants - Pointes avec filtre Extraction Phénol/Chloroforme Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN - Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines - Anti-RNases