Réunion Biomarqueurs Grand Est Institut Curie, Paris - France Evaluation Externe de la Qualité pour améliorer le Diagnostic Moléculaire des Tumeurs Solides Cancer du poumon et du côlon  Réunion Biomarqueurs Grand Est Strasbourg, 3 et 4 mai 2013 Dr Etienne Rouleau Institut Curie, Paris - France http://www.fotocommunity.de/pc/pc/cat/9479/display/30415918

Critères de performances

Critères de performance Réponse clinique Objectif : identification des tumeurs sensibles au traitement Identification des cancers colorectaux KRAS sauvages Identification des cancers du poumon EGFR mutés Taux de réponse Taux de réponse                Anti-EGFR : 43% [28-57]    DIAG           10% of patients with metastatic colorectal cancer who are refractory to chemotherapy respond to treatment with panitumumab or cetuximab       Anti-EGFR : 10% Anti-EGFR : <2%   F Di Fiore et al British Journal of Cancer (2010) 103, 1765–1772.

Critères de performance Réponse clinique 45 publications Se 0.49 (CI, 0.43 to 0.55) Sp 0.93 (CI, 0.87 to 0.97). Dahabreh et al Ann Intern Med. 2011;154:37-49.

Critères de performance Un unique test ?

Critères de performance Detection method* Sequencing (n=4) Se 0,47 (0・35–0・60) Sp 0,87 (0,62–0,96) Other (n=3) Se :0,48 (0,42–0,54) ・・ Sp 0,99 (0,89–1,00) Linardou H et al The Lancet Oncology 9,2008 : 962-972 Ex2 bi-ds : 34,4% (87/253) Se 0,47 [0,35-0,60] Sp 0,87 [0,62-0,96] AD : 37,6% (225/598) Se 0,48 [0,42-0,54] Sp 0,99 [0,89-1,00]

Critères de performance Hétérogénéité des méthodes (1) Taqman (2) HRM (3) Pyroséquençage (4) SNAP Shot (5) Séquençage direct (1) Spathis A et al. Anticancer Res. 2010 Jun;30(6):1969-75. (2) (5) (4) Besoin de standardisation des pratiques STIC ERMETIC / MOKAECEM Contrôles de qualité Contrôle qualité KRAS : Allemagne – KRAS (3) Di Fiore F et al. British Journal of Cancer (2007) 96, 1166 – 1169 7

Critères de performance Hétérogénéité des méthodes Nomber of patients KRAS+ KRASwt NC Sanger Sequencing 1913 37% 63% 5% HRM/sequencing 3748 35% 65% 6% Pyrosequencing 2457 37% 63% 4% Allele specific (Taqman…) 5133 40% 60% 3% Snap Shot 1926 42% 58% 10% Other methods 1123 38% 62% 3% Total 16 300 38% 62% 5% Data 2009 INCA – on declaration - 946 patients without any technique information KRAS+ : muted KRAS, KRASwt : wild-type KRAS, NC : non contributive

Critères de performance Hétérogénéité des méthodes– KRAS B) C) 33 11 6 3 ?? Life Tech qiagen Roche Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses KRAS, B) Sensibilité globale déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse. 5 participants utilisent au moins un kit commercial Therascreen KRAS Pyro (Qiagen - CE-IVD) / COBAS KRAS Autres sociétés impliquées : 11 Life Tech, 6 Qiagen, 3 Roche

Critères de performance Méthodes maisons – KRAS -11-94 111+48 Tableau : Distribution des amplicons en fonction des amorces déclarées dans le cadre du STIC MOKAECM. En majuscule, région avec une forte homologie sur la partie codante du gène KRAS.

Critères de performance Hétérogénéité des méthodes– KRAS Tableau : Evolution des techniques utilisées pour le génotypage KRAS en France entre le STIC MOKAECM en 2009 et l’EEQ 2012.

Critères de performance Hétérogénéité des méthodes – EGFR exon 21 B) C) Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses EGFR exon 21, B) Sensibilité globale déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.

Critères de performance Un laboratoire = une technique un protocole Plusieurs laboratoires = une technique un protocole Plusieurs laboratoires = plusieurs techniques plusieurs protocoles

Critères de performance Quelle est la performance réelle des analyses moléculaires KRAS and EGFR au niveau national ? Plusieurs facteurs : techniques (AS/DS), protocoles / SOP, organisation du laboratoire Critère principal : Réponse au traitement Critères indirectes Statistique des mutations Sans biais de sélection : ERBB2, KRAS Avec un biais de sélection : EGFR Validation de méthode : limite de détection Contrôles internes de qualité Contrôles externes de qualité GGT GGC 34 35 38 (AS) (DS)

Programme KRAS & EGFR EQA

Organisation Contexte Bonne pratique de laboratoire Preuve de la compétence Accréditation des laboratoires Nombreux tests « maisons » Suite de MOKAECM / ERMETIC Ne pas confondre EEQ et CQI EEQ et leurs recommandations Recommandation ESP ISO17043

Organisation Programme participatif Nijmegen Leuven Curie AFAQAP Partner Platforms Joint partners Reference Platforms

Organisation Programme participatif Plateformes partenaires EGFR Ile de France Ouest - Hôpital de FOCH (Dr DENOUX – Plateforme HUVEGEN), Centre Hospitalier Universitaire de Nancy (Pr VIGNAUD), Paris - Hôpitaux Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Béclère (Pr LEMOINE), Lille – Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), Clermont – Centre Jean Perrin (Pr PENAULT-LLORCA), Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET), Marseille – Assistance-Publique des Hôpitaux de Marseilles (Pr OUAFIK) KRAS Bordeaux - Institut Bergonier (Pr SOUBEYRAN), Centre Hospitalier Universitaire de Nice (Dr PEDEUTOUR), Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET-Dr LE MARECHAL), Paris - Hôpital Ambroise Paré (Pr EMILE), Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), Centre Hospitalier Universitaire de Rouen (Pr SABOURIN), Lyon - Centre Léon Bérard (Dr WANG) Plateforme de référence : Nijmegen laboratory (H van Krieken, M M.Ligtenberg)

Expert moléculaire Expert pathologique Expert qualité ANONYMISATION

Organisation Pourquoi 10 échantillons ?

Organisation Matériel de référence ADN Extrait ADN Plasmides Bloc artificiel Contrôle de tout le processus Tout Partiel Partiel Tout / partiel = spécimen biologique Identique Partiel Non Proche Prêt à l’emploi Lames Oui Oui Lames Reproductible A valider A valider Oui Oui / à valider Quantité disponible Limitée Limitée Illimitée Illimité Stabilité dans le temps Limitée Limitée Oui Oui Eventail de situation Limité Limité Important Important Consentement / éthique Oui Oui Non Non CIQ Calibrateur CEQ

Organisation Périmètre et objectifs HES Analyse histologique Sélection du matériel Enrichissement ADN Bloc Analyse moléculaire 3 lames 6µ Choix technologique Process analytique

Organisation Participants Participation nationale 45 EGFR / 50 KRAS participants EGFR : 4 KRAS : 9 EGFR & KRAS : 41 450 EGFR et 500 KRAS cas (3 lames)

Résultats GENOTYPE

Génotype Bilan des erreurs 9 erreurs concernant 8 participants KRAS 4 erreurs 3 participants avec au moins 1 erreur (6%/50) 0 participant avec une erreur de génotype grave EGFR 5 erreurs 5 participants avec au moins 1 erreur (11%/45) 4 participants avec une erreur de génotype grave

Génotype Bilan des erreurs 4 erreurs avec des conséquences thérapeutiques Un faux positif (1 EGFR « activating mutation ») : -2 points Deux faux négatifs (2 EGFR) : -2 points Un échec d’amplification (1 EGFR exon 21 mutation) : -2 points 5 erreurs sans conséquence thérapeutique Erreurs de mutation (2 KRAS – 1 EGFR) : -2 points Un échec pour un KRAS muté (1 KRAS muté) : -2 points Une erreur d’échantillon sur le rapport (1 KRAS muté ) : -1 point

Génotype Sensibilité et spécificité nationale KRAS Sensibilité : 100% Spécificité : 100% 0% erreurs avec un impact thérapeutique EGFR Sensibilité : 98,7% Spécificité: 99,6% 0,89% erreurs avec un impact thérapeutique Tables : Résultats globaux des EEQ KRAS et EGFR.

Génotype Données de la littérature UK NEQAS EGFR Deans ZC, et al. J Clin Pathol 2013;66:319–325. 3 rounds 2010-2011: Erreurs : 24% - 6,7% - 6,4% 49 participants dernier round UK NEQAS GIST KIT/PDGFRA Wong et al. J Clin Pathol 2012;65:786–790. 13%, 33%, 19% et 4% (2008-2011) 8 à 16 participants

Génotype Exactitude du génotype Description de la délétion EGFR : délétion sans description (7 cases) EGFR : erreurs de génotype (13 cases) Echantillon EGFR : B200 Mutation : c.2239_2248delinsC, p.Leu747_Ala750delinsPro c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del c.2238_2249delinsP, p.Leu747_Ala750delinsPro c.2239_2247del ; p.Leu747_Glu749del c.2236_2248delinsGAAC, p.Leu747_Ala750delinsPro Echantillon EGFR : B484 Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del Echantillon EGFR : B009 Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del

Génotype Sur-interprétation ? Echantillon EGFR B110 Non exclusion 4/23 soit 17% d’échec Interprétation : échec ou sauvage Laboratoire de référence : échec Curie / Partenaire : sauvage NC Percentage of neoplastic cells B110 EGFR (NC : test failure) Nombre de participants

Génotype Sur-interprétation ? Importance d’avoir des seuils d’interprétation 

Résultats DELAI DE RENDU

Délai de réponse Approche analytique Le délai de réponse de chaque participant sera évalué entre l’arrivée des échantillons au laboratoire et la validation du rendu des résultats sur le site internet: celui-ci étant idéalement de 10 jours (en référence aux nécessités cliniques), l’analyse comparera le résultat du laboratoire par rapport à l’ensemble des laboratoires français. Délai : réception du colis – soumission sur le site EGFR - moyenne 16,6 jours KRAS - Moyenne 14,6 jours

Délai de réponse Programme KRAS 32/50 Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ KRAS (classe 5).

Délai de réponse Programme EGFR 27/45 Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ EGFR (classe 5).

Délai de réponse Corrélation KRAS et EGFR Délai EGFR Figure : comparaison des délais de rendu pour les participants aux deux programmes EGFR et KRAS

Résultats COMPTE-RENDU

Comptes-rendus Approche analytique Les comptes rendus fournis par les participants sont analysés systématiquement en vue de formuler des recommandations d’amélioration ; l’évaluation portera sur l’interprétation, les données saisies et la présence de plusieurs items selon les recommandations de l’INCa Grille des contrôles EQA Européens Anonymisation de tous les comptes-rendus Double lecture de tous les rapports

Comptes-rendus Interprétation % des réponses correctes Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

Comptes-rendus Interprétation % des réponses correctes Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

Comptes-rendus Score EQA ESP (/4.5)

Comptes-rendus Score EQA ESP - KRAS (/4.5) 12/50 Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ KRAS.

Comptes-rendus Score EQA ESP - EGFR (/4.5) 9/45 Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ EGFR.

Comptes-rendus Points à améliorer Moins de 50% de participants avec l’item Sous numéro d'échantillon : numéro de coupe Nombre de lames : 3 Raison de la prescription : « mise sous traitement » Limite de détection de la technique Pagination Date de prélèvement NM séquence de référence

Cellularité

Estimation de la cellularité Cellularité KRAS Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2013 (ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

Estimation de la cellularité Cellularité EGFR Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2012 (ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

Estimation de la cellularité

Facteurs de performance

Données statistiques Lien entre activité et délais de rendu Nombre d’analyse KRAS par an

Données statistiques Participation à des EEQ - KRAS Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse KRAS Impact sur le score du compte-rendu EEQ en general pas d'impact 71% EEQ régional NS négatif oui 67,5% vs non 72,38% EEQ Europeen NS meilleur oui 74% vs 70% CQ EQA NS meilleur oui 75% vs 70%

Données statistiques Participation à des EEQ - EGFR Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse EGFR Impact sur le score du compte-rendu EEQ en général NS plutôt négatif 72% non et 70,17% oui EEQ régional NS plutot neg 72% non et 69% oui EEQ européen NS oui 73,5% vs 71,4% non

Données statistiques Accréditation / certification 3 participants avec l’analyse dans la portée d’accréditation 2 participants avec l’analyse dans la portée d’accréditation Tables : Nombre de participants accrédités ou certifiés – portée d’accréditation

Conclusion

Conclusion Performance nationale KRAS 100% EGFR <100% Hétérogénéité des méthodes Spécificité du programme français Programme participatif national Matériel de référence : 3 validations Animation d’un réseau Facteur de performance Activité (pas sur le génotype) Participation à des EEQ

Conclusion Performance n’est pas que l’EEQ Importance d’un travail commun d’amélioration et d’homogénéisation des pratiques Nécessité d’une intégration européenne Nécessité d’un matériel qualifié Contrôle de qualité externe Contrôle de qualité interne Nécessité de recommandation d’interprétation Bases de données de mutations Mise en place d’un réseau d’essai fonctionnel Vers une approche multiparamétrique BIOMARKER TESTING IQC EEQ SOP accreditation

Conclusion Approche multiparamétrique Harris TJ, McCormick F. Nat Rev Clin Oncol. 2010 May;7(5):251-65. Epub 2010 Mar 30. 59

Translocation EML4-ALK Conclusion Approche multiparamétrique Thyroid cancer Mutations KRAS Mutations BRAF Melanoma Mutations BRAF Lung Cancer Mutations EGFR Amplification EGFR Mutations KRAS Translocation EML4-ALK Breast cancer Amplification ERBB2 GIST Mutations c-KIT Mutations PDGFRα … Exclusion à valider… Colorectal cancer Mutations KRAS Mutations BRAF

Conclusion Approche multiparamétrique B) C) Tableaux : Réponses au questionnaire d’inscription pour les paramètres à ajouter à l’EEQ 2013. A) Cancer du colorectal, B) Cancer du poumon, C) EEQ d’extraction

Conclusion Approche multiparamétrique Fournisseur d’EEQ Identification du matériel Qualification du matériel Vérification de la qualité et du génotype Technique médiane Validation externe Validation NGS (PGM – AmpliSeq Côlon / Poumon) EQA 2013 56 Participants : 46 EGFR – 50 KRAS Approche multiparamétrique KRAS, BRAF, MSI EGFR, KRAS Amélioration de la qualification 10 mutations validées 10 variants supplémentaires d’intérêt détectables

Merci pour attention ! Programme KRAS & EGFR Jean-François Emile Yves Denoux Pierre Laurent-Puig & Hélène Blons Cédric Le Marechal & Laurent Doucet Jean-Marc Guinebretière – Xavier Sastres Antoinette Lemoine Karen Leroy L’houcine Ouafik Florence Pedeutour & Paul Hofman Frederique Penault-Llorca Jean-Christophe Sabourin Isabelle Soubeyrans Jean-Michel Vignaud Qing Wang Fahrid Zemerich AFAQAP Jean-Pierre Bellocq Caroline Egele Dominique Fetique Institut Curie Catherine Noguès Ivan Bièche Catherine Andrieu Chloé Derouet Frédéric Maraone Audrey Margogne Departement of Pathology of the Radboud University Nijmegen Medical Centre Han van Krieken Marjolijn Ligtenberg Institut National du Cancer Etienne Lonchamps Frédérique Nowak Biomedical Quality Assurance Research unit of the University of Leuven Els Dequeker Silke Sterck Lien Tembuyser Plateforme NGS Thomas Rio Frio Virginie Bernard Quentin Leroy 63