Marqueur VASP : aspects méthodologiques, validation technique Pr L Camoin-Jau Pr J Sampol Laboratoire d’Hématologie INSERM EMI 0019 Hôpital de la Conception Marseille ******* GEHT Paris 9 et 10 Octobre

- + ADP PGE1 AC - + AMPc - + PKA Inactivated Activated IIb-IIIa complex VASP VASP-P complex Ticlopidin and clopidogrel inhibit selectively the activation of the P2 Y12 ADP receptor. Adenylate Cyclase (AC) is Inhibited by activators like ADP and Activated by vasodilators like PGE1 or PGi2 Once activated, AC enhances the cyclic Adenosin monophosphate (CAMP) synthesis, inducing CAMP-dependent Protein Kinase activation. This Kinase phosphorylates many proteins including the Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) also regulated by phosphatase protein (PP). Phosphorylation of VASP is highly correlated to the degree of platelet fibrinogen brinding to GP/IIb IIIa inhibition and may serve as a marker for platelet reactivity. No Fibrinogen binding PP Fibrinogen binding Resting Platelet Activated Platelet Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-7

Platelet VASP-FCM Biocytex Mesure de la capacité de l’ADP à inhiber la phosphorylation de VASP Principe Marquage de VASP-P en immunofluorescence indirecte après fixation et perméabilisation Analyse en double couleur

Perméabilisation cellulaire et immunomarquage Principe du test Tube 1 Tube 2 Tube 3 10 µl de PGE1 10 µl sang citraté 10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté 10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté Vortex – Incubation 10 min Fixation 10 µl Vortex – Incubation 5 min Perméabilisation cellulaire et immunomarquage 10 µl Ac anti-VASP-P 10 µl Ac anti-VASP-P 10 µl Contrôle isotypique Vortex – Incubation 5 min Révélation et contre-marquage plaquettaire 10 µl Ig polyclonal –FITC – CD61 PE Dilution Lecture (2 h)

Analyse cytométrique Protocole compensé GB Ac anti-VASP-P Condition Plaq Ac anti-VASP-P Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Isotype contrôle Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Positionnement de la fenêtre d’analyse Ac anti-VASP-P Condition PGE1 MFI Axe Y

Analyse cytométrique Protocole Non Compensé GB Ac anti-VASP-P Plaq Ac anti-VASP-P Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Isotype contrôle Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Positionnement de la fenêtre d’analyse Ac anti-VASP-P Condition PGE1 MFI Axe Y

Calcul de l’index de réactivité des récepteurs à l’ADP MFIc PGE1 – MFI c (PGE1 + ADP) X 100 MFIc PGE1

Résultats préliminaires ns 100 ns 75 Index de réactivité plaquettaire 50 25 Normaux (n=5) Plavix (n=3) Mauvais répondeurs SANS compensation AVEC compensation

Essais de répétabilité Protocole non compensé Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Test 5 Moy CV T1 7.8 8.24 8.39 8.26 8.2 T2 2.94 2.96 2.9 3.13 2.99 T3 1.9 2.03 2.06 2.17 2.02 Index de réactivité % 82.4 85 86.7 84.2 84.3 84.5

Essais de répétabilité Protocole compensé Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Test 5 Moy CV T1 7.46 7.98 8.07 7.75 7.92 T2 2.28 2.39 2.42 2.44 2.27 T3 1.39 1.65 1.63 1.7 1.59 Index de réactivité % 85.3 88.3 87.7 87.8 89.3

Application clinique Mesure de la phosphorylation de VASP chez des patients traités par thiénopyridines ayant présenté ou non une thrombose artérielle sub-aiguë après ATCP Groupe I (n =16): patients avec une thrombose de stent sub-aiguë Groupe II (n=30) : patients sans complication thrombotique

Données démographiques Group SAT (n=16) Group No SAT (n=30) p Fibrinemia (g/l) 4.5 1.5 3.8 1.3 ns Platelets (G/l) 311  88 286  74 Duration of thienopyridines pretreatment (days) 4.4  1 7 7.6  7.4 Eptifibatide before (%) 29.4 37.5 Age 66  15 69  8

Résultats 63.30% 39.80% p < 0.0001 No SAT SAT 70% 60% 50% 40% 30% This figure indicates a strong significant difference between the 30 patients of group 3(in green) without any thrombotic event and the 16 patients of goup 4 with stent occlusion(in red) concerning our « thienopyridine time », respectively 39.8% vs 63.3% 20% 10% 0% No SAT SAT

Conclusion Trousse aujourd’hui disponible et utilisable facilement Indication : suivi des traitements par thiénopyridines Relevance clinique reste à confirmer