PR-10 genes in apple seedlings (Malus domestica): identification, characterization and spatio-temporal expression after induction by acibenzolar-S-methyl (ASM), a functional analogue of salicylic acid. Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). Presentation, PhD Thesis, Biology, Ecole doctorale de Rennes 1, France. Smaïl Ziadi © 2001

2- Présentation du modèle d’étude. Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). 1- Situation du sujet. 2- Présentation du modèle d’étude. 3- Objectifs. 4- Résultats obtenus. 5- Conclusion générale. 6- Perspectives. Ziadi © 2001

Réponse de la plante aux stress Salinité Sécheresse Eliciteurs chimiques Blessure Bactéries Champignons Virus Stress Facteurs de virulence et d’avirulence Facteurs physiques et/ou chimiques Eliciteurs biotiques Eliciteurs abiotiques Plante 1 1 : Défense constitutive 2 2 : Défense inductible Ziadi © 2001

Représentation spatio-temporelle des réponses de défense de la plante Temps relatif Intermédiaire/ long Protéines PR Protéines PR intermédiaire Rapide/  Voies des phényl- propanoïdes  Protéines PR Rapide HR  Flux d’ions  Burst oxydatif Cascade de phospho- rylation Mort cellulaire Distance/site de stress Point de stress Défense locale Défense systémique Ziadi © 2001

Principales voies de signalisation Infection par un agent pathogène Blessure + Production de l’AJ et C2H4 Production de l’AS - Protéines PR inductibles par l’AS Protéines PR inductibles par toutes les voies de signalisation Protéines PR non inductibles par l’AS Ziadi © 2001

Définition des protéines PR* Protéines de la plante induites dans des : - Situations de pathologie. ou - Situations liées à la pathologie. l’application des éliciteurs chimiques. * van Loon et al., 1994 Ziadi © 2001

Classification des protéines PR Famille Propriétés Symboles des gènes PR-1 Inconnue Ypr1 PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)] PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid PR-5 Thaumatin-like Ypr5 PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’) PR-7 Endoprotéinase Ypr7 PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10 PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic PR-12 Défensine Ypr12 PR-13 Thionine Ypr13, Thi PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp Famille Propriétés Symboles des gènes PR-1 Inconnue Ypr1 PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)] PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid PR-5 Thaumatin-like Ypr5 PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’) PR-7 Endoprotéinase Ypr7 PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10 PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic PR-12 Défensine Ypr12 PR-13 Thionine Ypr13, Thi PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp van Loon et van Strien., 1999 Ziadi © 2001

La famille PR-10 1- Poids moléculaire : 16 – 18 kDa. 2- Identification basée sur l’homologie de séquences. 3- Particularités : - Protéines PR acides intracellulaires - Pouvoir allergène 4- Induction : - Stress biotiques - Stress abiotiques - Stades physiologiques 5- Activité enzymatique suspectée : - Ribonucléase Ziadi © 2001

3- Activateur de la résistance : acibenzolar-S-methyl (ASM). Modèle d’étude 1- Gènes candidats : Gènes PR-10. 2- Matériel végétal : Pommier, semis du cv. Golden Delicious. 3- Activateur de la résistance : acibenzolar-S-methyl (ASM). Ziadi © 2001

Les protéines PR-10 du pommier : connaissances actuelles 1- Famille multigéniquea. 2- Identification de 2 gènes : AP15 b et Mal d 1c. 3- La majorité des travaux sont de type allergologique. 4- Analyse de la régulation du gène AP15 d. a Walter et al., 1996. b Atkinson et al., 1996. c Vanek-Krebitz et al., 1995. d Pühringer et al., 2000. Ziadi © 2001

Le pommier 1- Modèle de référence. 2- Intérêt agronomique. - Mécanismes de défensea. - Cartographie du génome du pommierb. 2- Intérêt agronomique. a Laboratoire du Feu Bactérien, UMR PaVé, Angers. b European Apple Linkage Map : Prima x Fiesta. Ziadi © 2001

acibenzolar-S-methyl (ASM) 1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliquea. 2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes. 4- Nombreuses qualités pratiques. 3- Protège le pommier contre le feu bactérien. 1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliquea. a Wendehenne et al., 1997. Ziadi © 2001

Acibenzolar-S-methyl Acide 2, 6-dichloroisonicotinique acibenzolar-S-methyl (ASM): analogue fonctionnel de l’acide salicylique Acide salicylique AS o oH Acibenzolar-S-methyl ASM o s N S CH3 Acide 2, 6-dichloroisonicotinique INA o oH N Cl Ziadi © 2001

Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl (ASM) Tissus infectés ndr1? cpr1? cim2 cim3 cpr1? lsd2 lsd4 nim1 npr1 NahG Interaction plante-agent pathogène Résistance Acquise Locale Acide Salicylique Expression des gènes de défense Nécroses ASM Signal systémique Tissus non infectés Résistance Systémique Acquise Acide Salicylique Expression des gènes de la SAR D’après Ryals et al., 1996 Ziadi © 2001

acibenzolar-S-methyl (ASM) 1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliquea. 2- Activateur de la résistance de plusieurs plantesb. 3- Protège le pommier contre le feu bactérienc. 4- Nombreuses qualités pratiquesd. a Wendehenne et al., 1997. b Ruess et al., 1996. c Brisset et al., 2000. d Godard et al., 1999. Ziadi © 2001

Objectifs de l’étude Les gènes PR-10 du pommier 1- Identification et caractérisation des gènes PR-10. 2- Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes PR-10 après application de l'acibenzolar-S-methyl (ASM). 3- Analyse de l’expression des gènes PR-10 après application d’autres stress abiotiques. 4- Localisation in situ des produits des gènes PR-10. Ziadi © 2001

Identification et caractérisation des gènes PR-10 du pommier Résultats obtenus Identification et caractérisation des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

Recherche des transcrits PR-10 RACE avec des amorces dégénérées Série de restrictions 4 classes d’inserts Séquençage d’un insert de chaque classe AP1, AP2, AP3, AP4 Ziadi © 2001

Analyse phylogénétique Séquences PR-10 du pommier Séquences PR-10 proches du pommier Q9SYV2 Q9SYV4 Q9SYV5 Q9SYV7 Q9SYV8 Q9SYV9 Q9S7M5 Q43549 Q43550 Q43551 Q43552 pru022521 Pyr065200 pru050001 Séquences PR-10 cv. Golden Delicious Séquences AP Q9SYV6 Q9SYW3 Q9SYV3 AP1 AP3 AP4 AP2 Séquences PR-10 du bouleau P43211/Mal d 1 Q40280/AP15 Bet v 1-Sc1 Ziadi © 2001

Analyse phylogénétique APb APa Ziadi © 2001

Représentation des séquences génomiques 500 pb 1000 pb 1500 pb tataaat +1 -885 E +78 atg +555 taa +790 AP1 APa W tataaat -502 +1 MJ +84 atg +732 taa +993 +438 aggc +268 aggt AP2 Ei APb tataaat -592 +1 E +73 atg +717 taa +997 +423 aggc +256 aggt AP3 Ei -861 tataaat +1 T E +80 atg +557 taa +816 AP4 Ziadi © 2001

Analyse de l’expression des gènes PR-10 du pommier Résultats obtenus Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

Représentation des séquences génomiques 500 pb 1000 pb 1500 pb tataaat +1 -885 +78 atg +555 taa +790 AP1 APa tataaat -502 +1 +84 atg +732 taa +993 +438 aggc +268 aggt AP2 APb tataaat -592 +1 +73 atg +717 taa +997 +423 aggc +256 aggt AP3 -861 tataaat +1 +80 atg +557 taa +816 AP4 Ziadi © 2001

Expression constitutive des gènes PR-10 Feuilles Pétioles Tige Racines R Racines F P T R APa APb Ziadi © 2001

Analyse de l’expression inductible des gènes PR-10 Pulvérisation: -ASM (1 mM) -H2O Prélèvement Prélèvement : 0 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 48 h 120 h Ziadi © 2001

Expression inductible des gènes PR-10 Expression locale Au niveau transcriptionnel Au niveau traductionnel 18 kDa 17 kDa Bet v 1 8 h 24 h 48 h H2O ASM H A 8 h 24 h 48 h APa APb Ziadi © 2001

Représentation schématique des séquences protéiques Hypothèse d’une modification post-traductionnelle 1 P-loop Pk Ck Ck Signature PR-10 159 AP1 AP4 APa 1 P-loop Signature PR-10 159 P-loop 1 Ck Signature PR-10 159 AP2 APb 1 159 AP3 Signature PR-10 P-loop Ziadi © 2001

Expression inductible des gènes PR-10 Analyse de l’expression systémique FNT Protection des deux jeunes feuilles FT Pulvérisation: -ASM (1 mM) -H2O Prélèvement : - FNT: feuilles non traitées - FT: feuilles traitées 0 h 48 h 120 h Ziadi © 2001

Expression inductible des gènes PR-10 Expression systémique FT FNT H A 48 h 120 h APa APb Ziadi © 2001

Analyse de l’expression d’autres stress abiotiques Résultats obtenus Analyse de l’expression des gènes PR-10 après application d’autres stress abiotiques Ziadi © 2001

Résultats obtenus 1- Éthylène. 2- Acide jasmonique. 3- Blessure. 4- Capsicéine. Ziadi © 2001

Application d’autres stress abiotiques Éthylène H 1 10 8 h 24 h 48 h APa APb Ziadi © 2001

Application d’autres stress abiotiques Acide jasmonique (0,1 mM) et Capsicéine (1 µg.ml-1) H Cap AJ 48 h 120 h APa APb Ziadi © 2001

Application d’autres stress abiotiques Blessure T APa APb B 8 h 24 h 48 h Ziadi © 2001

Localisation des produits des gènes PR-10 du pommier Résultats obtenus Localisation des produits des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

Localisation in situ des transcrits PR-10 Xy Barre d’échelle : 25 µm Ei Pp Es Pl Barre d’échelle : 25 µm Ziadi © 2001

Localisation in situ des protéines PR-10 Ei Xy ES Barre d’échelle : 25 µm Ei ES PL Pp Barre d’échelle : 25 µm PH Ziadi © 2001

Conclusions et Perspectives Ziadi © 2001

Conclusions Identification et caractérisation des gènes PR-10 1- Quatre transcrits PR-10 ont été identifiésa dans les feuilles. 2- Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3). 3- Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés. 4- Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente. a GeneBank data base: AY026909 (Ypr10*Md.d). AY026908 (Ypr10*Md.b) AY026911 (Ypr10*Md.a) AY026910 (Ypr10*Md.c) Ziadi © 2001

Conclusions Expression spatio-temporelle des gènes PR-10 1- Expression constitutive uniquement au niveau des racines. 2- Expression après application de l’ASM : 1- Très forte au niveau local. 2- Significative au niveau systémique. 3- Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène. 4- Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine. Ziadi © 2001

Conclusions 1- Les tissus conducteurs. SMAÏL ZIADI, PASCAL POUPARD, MARIE-NOËLLE BRISSET, JEAN-PIERRE PAULIN and PHILIPPE SIMONEAU. Characterization in apple leaves of two subclasses of PR-10 transcripts inducible by acibenzolar-S-methyl, a functional analogue of salicylic acid Physiological and Molecular Plant Pathology (2001) 58, 33-43. Localisation in situ des produits des gènes PR-10 1- Les tissus conducteurs. Les tissus du phloème. 2- Les parenchymes palissadiques. Ziadi © 2001

Rôles suggérés pour les protéines PR-10 1- Rôle dans les mécanismes de défense. 2- Rôle dans le développement de la plante. Ziadi © 2001

Perspectives Fonction biologique 1- Analyse de l’expression des gènes PR-10 du pommier après un stress biotique. 2- Localisation cellulaire des produits des gènes PR-10. 3- Cartographie des gènes PR-10. 4- Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10. Ziadi © 2001

Aspect allergénique des protéines PR-10 Breiteneder et Ebner, 2000 Ziadi © 2001

Allergènes des aliments homologues aux protéines PR Sources d’allergènes PR-2 fruits et légumes. PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane. PR-4 navet. PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23). PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH). PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge. Allergènes homologues à Sources d’allergènes PR-2 fruits et légumes. PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane. PR-4 navet. PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23). PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH). PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge. Breiteneder et Ebner., 2000; Hoffmann-Sommergruber, 2000 Ziadi © 2001

Aspect allergénique des protéines PR-10 H A50 A100 A200 APa APb ASM Ziadi © 2001

Protection des cultures par l’application des éliciteurs chimiques Question ouverte Protection des cultures par l’application des éliciteurs chimiques Induction des protéines allergènes Risques pour les consommateurs ? Évaluation des risques allergéniques Ziadi © 2001

Perspectives Évaluation des risques allergéniques 1- Vérification de l’allergénicité des protéines AP. 2- Suivi de l’expression des gènes PR-10 dans les fruits avant et après application de l’ASM. 3- Recherche d’autres activateurs de la résistance qui n’induisent pas ou faiblement les gènes PR-10. Ziadi © 2001

Encadrement - M. PAULIN J. –P. - M. SIMONEAU P. - M. POUPARD P. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale - M. SIMONEAU P. Laboratoire de Microbiologie Végétale - M. POUPARD P. Laboratoire de Microbiologie Végétale - Melle. BRISSET M. –N. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale Ziadi © 2001

Merci pour votre attention Ziadi © 2001

Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). Ziadi © 2001