1- Pouvez-vous nous parler d’un cas de Bronchite infectieuse que vous auriez rencontré ? 2- Quels moyens avez-vous mis en oeuvre ? 3- Quel ont été les résultats ? 4- Quels besoins avez-vous identifiés pour aller plus loin ?

Atelier REPRO

Cas clinique Contexte : 1 parquet de Repros de 30 semaines : Chute De Ponte 8%, œufs blancs, déclassés et comportement fiévreux. Ponte pas récupérée (Rq : différencier 8% vs. 8 points (différence surtout en repros)) Prélèvements PCR BI MS GTI. => BI 4/91 positif. Prophylaxie réalisée : J1 Ma5 4/91 5s Ma5 Clone 30 11s 4/91 18s IBMulti  

Cas clinique Moyens mis en œuvre : Présence de virus pas forcément corrélée à chute de ponte, et animaux régulièrement challengés. Challenge IB 4/91 sur une vaccination 4/91 ratée peut provoquer une BI clinique. Action : vaccination en ponte : avant le pic et après le pic. Qualité de vaccination : Il faut plus de 95% de poules bien vaccinées : Si 5% n’ont pas eu une vaccination correcte (inactivé ) : ce sont celles-là qui peuvent chuter. La qualité de l’échantillonnage est importante : en nombre et en endroit : le faire en diagonale dans le bâtiment en répartissant les prélèvements Ma5/4-91 : a mieux marché.   Ma5/Rhino CV peuvent être faits ensemble. 4/91 à suivre. Dans une zone à forte prévalence, il peut y avoir des challenges avant la revaccination 4/91.

Cas clinique Vaccination poussinière à côté de bâtiment en ponte : vacciner tous les bâtiments en même temps pour éviter les réactions vaccinales. Question : Combien de jours acceptables de décalage quand y a plusieurs bâtiments à vacciner ? Le plus court possible. Le critère : c’est vacciner avant l’excrétion cloacale et circuits de circulation entre les 2. En ponte sortie de bâtiment (réforme des pondeuses) : vacciner les poules qui restent, 2-3 semaines avant pour prévenir les réactions à la sortie. Titres en BI à attendre post vaccinal : il faut 4000 après les 4 vivants.

Cas clinique Pour aller plus loin : Pb : absence de sérothèque en contexte pression terrain forte et donc titres anticorps élevés En sérologie post inactivé : ajouter la valence Newcastle (valable pour animaux en zone indemne de challenge ND Inconvénient de la séro : sur animaux vaccinés sur programme satisfaisant en théorie et challengés avant la ponte : difficile à interpréter. => recours à la PCR. Gestion : séro sur collatéraux, et vaccination en ponte 4/91 et/ou 4/91 Ma5

Atelier CHAIR

Cas de poulets labels Symptômes vers 70 j : arrêt de croissance, « crêtes bleues » Non vaccinés BI en élevage Sérologies fin de lots: titres ELISA positifs avec CV plutôt faibles Les poulets n’étant pas vaccinés, conclusion de passage BI, Mise en place de la vaccination 4-91 à 14 jours en élevage, par pulvérisation, les poulets étant rassemblés dans des ronds Disparition des symptômes sur les lots suivants

Poulets labels: comparaison de 2 protocoles de vaccination Protocole habituel: H120 au couvoir puis 4-91 dans l’eau de boisson (avec la gumboro) à 21 j Protocole expérimental: MA5 et 4-91 au couvoir en pulvérisation Résultats des IHA et PCR X-OVO: Meilleure prise vaccinale sur lots vaccinés au couvoir (même si on retrouve des titres IHA et du virus vaccinal en PCR sur les lots vaccinés eau de boisson) La vaccination au couvoir MA5 et 4-91 est une solution lorsque la question de la qualité de la vaccination en élevage se pose

Poulets standards Contexte de mauvais résultats technico économiques, avec colibacilloses Recherche en fin de lot par sérologie BI et gumboro Titres élevés en BI compatibles avec un passage sauvage (les symptômes en élevage n’y avaient pas forcément fait pensé) Mise en place d’une vaccination 4-91 à 15j en pulvérisation: amélioration du niveau sanitaire de l’élevage et des résultats économiques

Conclusions de l’atelier chair Importance du diagnostic, nécessité d’outils d’analyse à disposition des praticiens Importance du matériel, pour une bonne application du vaccin, adapté aux types d’élevage Intérêt de la vaccination BI aussi dans le contrôle des surinfections

Atelier PONTE

Ateliers PONTE 1er cas : Poules plein air de 52 sem Symptômes : mortalité, picage, un peu de Coli œufs blanc, bagués, déformés Conso aliment : normale, voire trop Courbe de ponte : correcte, pas de chute Séro : 25 sem : ND de ¼ à 1/32 (2 à 5 log2) : faible 50 sem : ND max à 1/1024, 1/64 et reste entre ¼ et 1/16 52 sem : BI 7814 Elisa Bck (24% CV) Attente nouvelle PS pour cinétique Pas de vaccination en ponte

Ateliers PONTE 2ème cas : Poules plein air avec problèmes de MS Ma5+4-91 au couvoir, puis Ma5 et 4-91 en élevage Décidé de faire : 4-91 15 j avant sortie sur parcours 4-91 à 40-45 semaines, au Sprayfan Depuis : plus besoin d’OTC moins d’œufs blancs baisse de ¾ des problèmes.

Ateliers PONTE 3ème cas : 110 000 poules en cages 91% de ponte à 60 semaines Augmentation mortalité : 15-20/j passé à 50-60/j Urolithiase Baisse de ponte à 84-85%, RAS sur les œufs Hypothèse : problème alimentaire? Histologie : suspicion BI rénale Sérologie 1 : normale Sérologie 2 en attente Reprise ponte à 89% Il y a eu des rappels Mass en ponte (dernier à 40 semaines)

Ateliers PONTE 4ème cas : 50 000 poules à 50 semaines, achetées à 18 semaines 91% ponte, puis baisse à 60% Mortalité RAS Œufs RAS Retour à la normale en 2 semaines, après des antistress Pas de rappel en ponte 75 semaines aujourd’hui : 76% ponte

Ateliers PONTE 5ème cas : Lot avec problème de Mycoplasmes, utilisation autovaccin Décidé d’encadrer le pic de ponte avec des vaccins vivants BI Transfert : +4j : Rhino CV + Ma5 +11j : 4-91 +8 sem : Ma5 +8 sem : Rhino CV + Ma5 +8 sem : 4-91 Avec Cage spray (2 passages) Depuis : très bonnes pontes

Conclusion de l’atelier PONTE Ne pas hésiter à vacciner en ponte : Vaccin vivant : en même temps qu’inactivé + 1 à 2 semaines avant le pic + 1 à 2 semaines après le pic Puis si contexte épidémiologique l’exige : (pression, multi-âges) Mass et variants alternés toutes les 8 semaines voire toutes les 4 semaines si besoin

Les questions les plus fréquemment posées

1/Le choix des échantillons dépend-il du contexte 1/Le choix des échantillons dépend-il du contexte? (Contrôle après vaccination ou maladie). Vaccination +2 sem; Vaccination + 1sem. vaccination Possibilité Virus vaccinal Éc. trachéaux Notre recommandation est de prélever des échantillons trachéaux dans les 2 premières semaines suivant la vaccination et cloacaux par la suite. Le prélèvement devrait être fait au moins une semaine post-vaccination afin de s'assurer que tout ARN récupéré est en fait le résultat de la réplication virale du vaccin et non pas les restes du vaccin qui a été administré par nébulisation ou dans l'eau de boisson. En règle générale, plus on s'éloigne de la date de l’évènement (vaccin ou épisode clinique), plus les prélèvements sur écouvillons cloacaux deviennent utiles. C'est parce que la plupart des virus disparaissent plus vite de la trachée qu'ils ne disparaissent du cloaque. Éc. cloacaux

2/Quand les oiseaux vaccinés ont présenté des signes cliniques, vous trouverez au niveau cloacal le virus sauvage, même si la charge virale du vaccin est élevée? Le séquençage classique (séquençage Sanger ) identifie la population dominante de virus Lorsque des virus sauvages colonisent des oiseaux, ils deviennent la principale population de virus Donc, en cas d’épisode clinique, la méthode permet de ne détecter que le virus sauvage. Théoriquement, la possibilité existe que vous puissiez prendre un échantillon assez tôt dans le cycle infectieux sur lequel on pourrait encore identifier le virus vaccinal parce que l'échantillon aurait été prélevé avant l’installation complète du virus de terrain. Par conséquent, si un vétérinaire reste absolument convaincu de la présence d'un virus sauvage de la bronchite infectieuse, un ré-échantillonnage devrait être réalisé afin d'éliminer la possibilité d’un échantillonnage trop précoce dans le cycle infectieux. L’utilisation d'un séquençage classique (appelée «séquençage Sanger ') identifie la population dominante de virus présent à partir du site d'échantillonnage. Lorsque des virus sauvages colonisent des oiseaux, nos observations ont montré qu'ils deviennent la principale population de virus - c'est parce qu'ils ont échappé au système immunitaire de l'hôte pour s’établir et se reproduire librement. Notre impression est que ce processus se déroule rapidement, donc dans la grande majorité des cas, lorsque vous avez une infection de terrain causant des maladies, la méthode vous permet de ne détecter que le virus sauvage.

3. Est-ce que la méthode de PCR quantitative permet de conclure que la vaccination a été bien faite (quel CT devrait-on obtenir?). Le test PCR quantitatif réel fournit une mesure très fiable et reproductible de la quantité d'ARN présente sur l'écouvillon ou la carte FTA. La variation est, cependant, inhérente au protocole d'échantillonnage. Ainsi, il est nécessaire d'établir les limites normales de fonctionnement pour les valeurs CT obtenues pour le type d'échantillon soumis -écouvillons contre carte FTA, cloaque contre trachée, etc prélèvement Valeur CT Trachée 2-6 sem après vaccination 4-91 25- 30 Cloaque 2-6 sem après vaccination 4-91 20-25 Cas clinique 15-petite vingtaine Flacon de vaccin 8-12 Nos observations pour le vaccin 4/91 indiqueraient que, en moyenne, 2-6 semaines après la vaccination par pulvérisation, les valeurs de 25 à 30 CT sont obtenues sur trachées, et des valeurs de 20 à 25 CT sur cloaques. Les virus sauvages qui semblent se reproduire de façon très agressive, donneraient des valeurs de CT allant de 20 à environ 15. La ponction d’un flacon de vaccin donne régulièrement des valeurs de CT de 8 à12.

valeurs réduites ( plus d’ARN présent) lorsque: 3. Est-ce que la méthode de PCR quantitative permet de conclure que la vaccination a été bien faite (quel CT devrait-on obtenir?). valeurs réduites ( plus d’ARN présent) lorsque: Carte FTA vs écouvillons échantillons post-mortem prélevés au laboratoire vs en élevage vaccination par pulvérisation vs eau de boisson Prélèvement Valeur CT Trachée 2-6 sem après vaccination 4-91 25- 30 Cloaque 2-6 sem après vaccination 4-91 20-25 Cas clinique 15-petite vingtaine Flacon de vaccin 8-12 Toutes ces valeurs sont réduites ( plus d’ARN présent) lorsque des échantillons de cartes FTA sont soumis, parce que les gens mettent plus de matrice d’échantillon sur la carte FTA. En outre, certains pays obtiennent des valeurs plus basses (plus d’ARN) parce que l'échantillon est plus frais : échantillons post mortem prélevés au laboratoire plutôt que des échantillons prélevés à la ferme. Bien qu'il soit possible de voir une bonne vaccination en eau de boisson nous voyons régulièrement des valeurs de CT supérieures (moins d’ARN) en eau de boisson qu’en cas de vaccination par pulvérisation

4. Le CT est-il corrélé avec l'intensité des symptômes, ou la pathogénicité du virus? L’étude n’a pas été effectuée en laboratoire. la pathogénicité globale d'un virus peut probablement être définie par l'interaction entre la quantité présente (en effet, l’activité de la réplicase - gène contrôlant le taux de réplication - a été expérimentalement associée à la virulence pour la souche M41) et la structure en 3 dimensions de la protéine S1. Ce n'est pas une étude que nous avons effectuée en situation de laboratoire. Il est probable que le résultat n'est pas clair avec tous les virus de terrain, car nous pensons que la pathogénicité globale d'un virus peut être définie par l'interaction entre la quantité présente (en effet, l’activité de la réplicase-gène contrôlant le taux de réplication-a été expérimentalement associée à la virulence pour la souche M41) et la structure en 3 dimensions de la protéine S1. Ce

5. Arrive-t-il que l’on isole plusieurs virus sur une même ferme? Ceci peut être démontré en échantillonnant plusieurs organes en même temps sur le même poulet. Vous pouvez par exemple trouver Ma5 dans la trachée et 4/91 dans le cloaque quand les deux vaccins sont administrés en même temps.

6. À l'autopsie, ce seront les meilleurs échantillons 6. À l'autopsie, ce seront les meilleurs échantillons? Écouvillons du cloaque ou d'organes? Tant que les oiseaux sont assez frais, nous ne croyons pas qu'il y ait une différence significative.

7. Pourquoi les virus sont facilement isolés à partir de prélèvements du cloaque? C’est probablement dû à la présence d’une plus grande quantité de virus (la plupart des virus sauvages et vaccinaux semblent donner des valeurs de CT plus faibles - de plus grandes quantités d'ARN – à partir du cloaque que de la trachée) et à l’excrétion cloacale prolongée (donc il y a tout simplement plus de chance que le virus soit présent lorsque vous écouvillonnez l'oiseau)

8. Lorsque nous soupçonnons une bronchite rénale, quels échantillons devrions-nous choisir? Les reins. Si le virus provoque une pathologie rénale nous devrions vraiment trouver le virus dans les reins.

9. Dans quels cas peut-on avoir de faux résultats négatifs? pas assez de matériel sur l’écouvillon ou la carte FTA.. pools de plusieurs sites de prélèvements – par exemple cloaques et trachées: il est alors possible de diluer un nombre plus faible de cloaques positifs avec plus de trachées négatives, générant ainsi un ensemble négatif ou non typable, à cause d’une quantité résultante d'ARN trop faible. si les échantillons ne sont pas réfrigérés rapidement ou envoyés rapidement pour l'analyse Tout simplement s’il n’y a pas assez de matériel sur l’écouvillon ou la carte FTA. L’analyse ne trouvera l’ARN que s’il est présent sur le coton ! le bon fonctionnement du test ne dépend essentiellement que de la capacité de la personne qui prend l'échantillon à obtenir suffisamment de matériel sur l'écouvillon. L'utilisation de pools de plusieurs sites de prélèvements – par exemple cloaques et trachées: il est alors possible de diluer un nombre plus faible de cloaques positifs avec plus de trachées négatives, générant ainsi un ensemble négatif ou non typable, à cause d’une quantité résultante d'ARN trop faible. Les échantillons qui ne sont pas réfrigérés rapidement ou envoyés rapidement pour l'analyse peuvent également conduire à des faux négatifs.

10. Pratiquement, lorsque les prélèvements sont prélevés à la ferme, combien de temps est-il possible de les conserver à la température ambiante? Pas plus de 1 jour si possible. Cependant, cela dépend vraiment des conditions environnementales parce que la question clé est la prévention de la contamination fongique. Les gaines charbon ne conviennent pas pour des recherches virales

Pour bien réaliser les prélèvements

La réalisation des prélèvements en Bronchite Infectieuse et Pneumoviroses Prélèvements viraux pour PCR par écouvillons : En Bronchite Infectieuse : prélever les sujets malades ou les sujets sains en cas de symptômes terminés ou pour une étude de prévalence En Pneumovirose : Prélever par Ecouvillon Trachéal (uniquement) les sujets non malades en cas de recherche lors de symptômes car le pneumovirus persiste peu de temps (3-5 J) dans l’appareil respiratoire supérieur ; il faut alors prélever les sujets en phase d’incubation. En cas de symptômes terminés les écouvillons trachéaux réalisés seront négatifs. Il faudra alors privilégier la sérologie. Réalisation de sérologie : Dans tous les cas une cinétique est obligatoire (au minimum 3 semaines entre les deux prélèvements) En poulet, une seule sérologie fin de bande, surtout si pas de rappel, est interprétable

Prélèvements viraux pour PCR : X OvO Matériel à utiliser : Uniquement des écouvillons secs, À tige métallique de préférence ou en plastique (raison : éviter au minimum les interférences avec le matériel génétique prélevé, pour une meilleure sensibilité de la technique PCR) Ne pas utiliser d’écouvillons au charbon Écouvillon sec

Prélèvements viraux pour PCR :X OvO Prélèvements pour étude et/ou Prospection : Réaliser des Ecouvillons Cloacaux (bien frotter l’écouvillon sur l’épithélium intérieur du cul de sac cloacal) Lors de Cas clinique avec suspicion de BI : Ecouvillons Trachéaux jusque 2 semaines après le début des symptômes Ecouvillons Cloacaux : si plus de deux semaines après les symptômes Méthode de prélèvement : Réaliser 10 écouvillons = 1 PCR Garder les écouvillons au froid (le plus rapidement possible) avant envoi à MSD ; les congeler de préférence. Envoi par transporteur en évitant la veille du Week-End ! EC = Ecouvillon Cloacal ET = Ecouvillon Trachéal

Prélèvements en élevage de volailles : Représentativité des prélèvements (écouvillons et prises de sang) : 20 prises de sang (PS) est le nombre minimal pour une représentativité statistique (à respecter en cas d’étude de prévalence, peut-être diminué si prélèvement en phase d’infection car prévalence de la maladie est alors élevée) En élevage au sol : en diagonale du troupeau en répartissant le nombre de PS à réaliser - En élevage en cage : idem en répartissant entre les étages des batteries