"POLYMORPHISME" Plusieurs Formes Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle soit ponctuelle ou qu'elle intéresse une répétition de séquence (mini / micro satellites) est un polymorphisme si sa fréquence est  1 % dans une population donnée à une fréquence < 1 % mutation (privée) Les polymorphismes sont soit : - Neutres - Avantageux - Désavantageux

(1 base différente pour 250 - 300 bases entre 2 allèles ou 2 séquences Les Polymorphismes L'ADN n'est pas un élément statique Il est sujet à des modifications (variations transmissibles) Les variations de séquence sont appelées polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une fréquence > 0.01 (moins de 1 % : mutations) L'hétérozygotie moyenne de l'ADN humain est d'environ 0,004 (1 base différente pour 250 - 300 bases entre 2 allèles ou 2 séquences entre 2 individus)

Le polymorphisme affecte toutes les régions de l'ADN - Séquences codantes - Introns - ADN répété (mini, microsat…) Il peut être la conséquence 1- d’ une simple substitution de nucléotide / SNP 2 d’une modification d’un site de restriction : cas particulier de SNP 3 d’une modification de taille d'un motif répété : polymorphisme de longueur

Polymorphisme SNP Single Nucleotide Polymorphism peut induire une  longueur sur un profil analysé par la méthode de southern et détectable par enzyme de restriction Polymorphisme de répétition Microsat Minisat

RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphism SNP : Single nucleotide Polymorphism RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphism VNTR : Variable Number Tandem Repeat minisat STR : Simple Tandem Repeat / Microsat

Les polymorphismes du DNA servent à son analyse La séquence d'un locus peut varier d'un individu à l'autre - RFLP (Variation ponctuelle de séquence affectant un site de restriction) (+ / -) (méthode de Southern, PCR) - VNTR : ou minisatellites. Polymorphismes de répétition (Nombre de copies différentes d'une séquence répétée > 10 pb x N) - STR : ou microsatellites (1 à 5 pb X N)

Le polymorphisme (de restriction) (ou de répétition) n'est pas nécessairement la cause de la maladie Il peut s'agir d'un polymorphisme marqueur d'une maladie sans qu'il en soit la cause Le fait qu'un polymorphisme soit près d'un gène muté (par exemple) , voire de la mutation , est utilisé comme marqueur de la maladie

RFLP Un RFLP est défini par un couple : Sonde / Enzyme (southern) ou par un couple taille/enzyme (PCR) Sa localisation précise, sa variabilité et sa transmission mendelienne lui confèrent un caractère de marqueur génétique codominant. Le couple sonde / enzyme se caractérise par : + / - et correspond à des allèles (Bi-allélisme) Ils sont mis en évidence par la méthode de southern ou PCR Pour être informatif : le RFLP doit être reconnu par une sonde unique Nombre de sites de restriction pour une enzyme donnée reconnaissant un motif hexanucléotidique : 46 = 4096 séquences possibles mais seules 64 combinaisons ont la symétrie palindromique réclamée par les enzymes de restriction et 41 combinaisons sont reconnues seulement par les enzymes déjà caractérisés donc 1 % seulement des polymorphismes par mutation ponctuelle sont détectés par les enzymes de restriction et constituent des RFLP

EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse Exemple EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne peut plus hydrolyser l'ADN à cet endroit. A B GAGTTC CTCAAG (A + B)

On distingue des sites de restriction obligatoires (toujours présents) et des sites de restriction variables  Polymorphisme MSt II 1 2 3 4 5 Chez un individu sur 100 on découvre  Apparition d'un nouveau site Mst II Mst II (position 1, 2, 3, 4 et 5) CCTNAGG GGANTCC

Ceci est valable dans une famille donnée Marqueur Position non connue avec précision Eco RI+ Gène 4kb Eco R1- Gène muté  maladie  M 5kb Ceci est valable dans une famille donnée Si on hérite du fragment 5kb  maladie

Les Minisatellites Hypervariables (VNTR) GGAGGTGGGCAGGA(A/G)G - Séquences répétitives, dispersées et très polymorphes - Il s'ajoute à cette variabilité un taux élevé de mutation - Ce sont donc des marqueurs polyalléliques sur tous les chromosomes sauf X et Y - La séquence est de type : GGAGGTGGGCAGGA(A/G)G et varie de 11 à 16 pb, répétée et en tandem - Ils permettent d'étudier la ségregation de nombreux loci - La probabilité de rencontrer deux individus non apparentés avec un profil identique de VNTR est < 10 -20

Minisatellites 20 - 100 pb répétées en tandem VNTR Polymorphisme Longueur des répétitions peut varier d'un individu à l'autre

- Si on sait repérer A et B, on en déduit la transmission du gène A et B sont deux marqueurs polymorphes encadrant le gène d'une maladie liée à l'X A B Gène - Hypothèse : le gène dont on veut suivre la ségrégation est "lié" à deux marqueurs - Si on sait repérer A et B, on en déduit la transmission du gène Imaginons qu’au cours de l ’ évolution, chez les individus qui ont le gène muté , il apparaisse incidemment une variation de séquence dans le marqueur A ;

Cette variation de séquence peut générer un Site de restriction Avant l'apparition du site de restriction la séquence était : CTGGG GACCC au cours de l'évolution : Substitution G > A CCTAGG GGATCC Site Bin 1

Ceci est un hasard / le site de restriction Bin 1 devient le marqueur de la maladie sans en être la cause. Le site est lié à la maladie, il y a un déséquilibre de liaison : Le gène muté responsable de la maladie, est associé à la présence du site Bin 1 plus souvent que le simple hasard ne le prévoit Attention ceci doit être vérifié pour chaque famille

Le polymorphisme (de restriction) (ou de répétition) n'est pas nécessairement la cause de la maladie Il peut s'agir d'un polymorphisme marqueur d'une maladie sans qu'il en soit la cause Le fait qu'un polymorphisme soit près d'un gène muté (par exemple) est utilisé comme marqueur de la maladie

Le Spectre des variations de séquence Mutations silencieuses (neutres) synonymes Le plus souvent pas de modification du message si mutation sur la troisième base du codon - Mutation non synonymes Le taux final de mutations de l'ADN codant << aux mutations de l'ADN non codant car 95 - 99 % ADN non codant

Un polymorphisme de restriction peut "accompagner" une maladie sans en être responsable

Polymorphisme de Répétition EcoRI EcoRI (CA)n Allèle A 200 pb EcoRI EcoRI + 2(CA)n Allèle B 300 pb sonde A/B A/A B/B 300 200