Bacterial adhesion probed at the molecular scale Bulard Emilie 2ème année de thèse Bacterial adhesion probed at the molecular scale Hydrophobic Hydrophilic bacteria Bernard Bourguignon Henri Dubost Marie-Pierre Fontaine-Aupart Marie-Noëlle Bellon-Fontaine Jean-Marie Herry Romain Briandet

Outline 1 – Introduction 2 – The Sum Frequency Generation Spectroscopy SFG 3 – Bacterial adhesion 4 – Results 5 – Conclusion and prospects

Aim of the study Bacterial biofilm : a public health problem… Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Bacterial biofilm : a public health problem… Method : SFG spectroscopy on self-assembled monolayers

Some theory… The femtosecond vibrational SFG technique : IR SFG Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects IR SFG Visible Non linear medium Sample to analyse Ep Visible SFG Interest : Centro-symmetric objects give no SFG signal. IR ω (cm-1) Spectroscopy well-adapted to ordered interface

SFG on the ODT SAM The choosen support : the OctaDécaneThiol (ODT SAM) Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects The choosen support : the OctaDécaneThiol (ODT SAM) CH3 S Au i X 7 elongation vibrations to take into account : CH3symmetric and asymmetric Fermi resonance of CH3 symmetric and asymmetric of CH2 near CH3 symmetric and asymmetric of CH2 near S Experimental : - visible beam at 800 nm - IR beam at 3 µm (obtained with an OPA) Bourguignon et al. Surface Science 2008; 602: 3551-3559

Bacteria Lactococcus lactis adhesion on the solid Model bacteria : Lactococcus lactis bacteria ; hydrophilic1 and its hydrophobic2 mutants, no pathogens with ovococoïd forms Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Epifluorescence image, 50x50 µm2 1Kulakauskas et al. Journal of biological chemistry 2009; 285:14 2Briandet et al. Microbiology 2007; 7:36 MEB image, 3 x 2.25 µm2, INRA Visible IR Sum Frequency CaF2 Or Air ODT SAM Bacteria in water Bacterial suspension (109 bactéries/mL) in water or KNO3 (10-1 M) Washing with solvent 1h30 adhesion ODT/Au Adhesion : SFG analyse

SFG spectrum on the ODT SAM in the air Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Profil spectral de l’IR (mesuré sur GaAs) Spectre SFG expérimental Spectre modélisé sous mathematica Résultat de la déconvolution Asym CH3 Fermi CH3 ω (cm-1) Sym CH3 I(ωSFG) α g(ωIR) χNR exp(iφ)+ Σ An n ωIR- ωn+iГ 2 Deconvolution of spectra : R = Symmetric signal of CH3 Asymmetric signal of CH3 R parameter : R (air) = 4

Bacterial adhesion effect on the ODT SAM SFG Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects ODT in water R (eau) = 5.8 ω (cm-1) SFG ω (cm-1) Air Water SFG ω (cm-1) ODT + hydrophilic bacteria in water ODT + hydrophobic bacteria in water R (hydrophilic bacteria) = 8.8 R (hydrophobic bacteria) = 3.8 Bacterial recovery : 70 %

Bacterial adhesion effect on the ODT SAM Signification of R parameter : Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Linked to the ODT SAM conformation a b (axe C3) c μa S Au μs E (axe C3) c μa μs S Au E MSFG α µ.E µs : dipolar moment of CH3 symmetric vibration µa : dipolar moment of CH3 asymmetric vibration Raising terminal CH3 R increases R = Symmetric signal of CH3 Asymmetric signal of CH3 Bacterial adhesion effect : Bactérie hydrophobe Bactérie hydrophile S Air O H Φ = 244° Θméthyl = 54° Φ = 250° Θméthyl = 52.5° Φ = 260° Θméthyl = 48.9° Φ = 238° Θméthyl =56.6°

Conclusion and prospects Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects SFG spectroscopy is a very sensitive technique ; allowing us to see bacterial adhesion effect on functionalized surface Hydrophobic and hydrophilic bacteria have different effect on the ODT SAM conformation. These results have been quantified by numerical simulations. For the design of new materials, these conformational changes have to be taken into account. Bulard et al. Langmuir 2011 Prospects : - Effect of proteins and {proteins + bacteria} adsorption - use of a functionalized prism in internal reflection configuration without dependence of the solvent anymore + kinetic experiment

? ? ? Questions ??? Thank you for your attention ! AsGa à analyser

Simulations numériques La molécule d’ODT SAM est représentée par 3 angles : Φ, θ et ψ1 avec Φ représentant l’orientation du plan des chaînes : l’intensité relative des bandes CH3 est très sensible à cet angle. et θ = 30° l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles ; ψ1 = 90°/100° caractérisant le défaut en bas de chaîne

ODT en présence de L.lactis Simulations numériques ODT à l’air ODT dans l’eau 244/333 ± 2° 250/340 ± 2° Φ tilt méthyl "ponté" 54 ± 0.7° 14 ± 0.7° 52.5 ± 0.7° 11.9 ± 0.7° tilt méthyl "ternaire" Φ tilt méthyl "ponté" ODT en présence de L.lactis hydrophiles 260/350 ± 3° hydrophobes 238/328 ± 3° 48.9 ± 1° 7.5 ± 1° 56.6 ± 0.7° 18.3 ± 0.7° tilt méthyl "ternaire"

La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG) Dispositif expérimental : l’Amplificateur Paramétrique Optique (OPA) Visible IR ω idler ω 800 ω signal Faisceau 800 nm pulsé fs Cristal AgGaS2 Cristal BBO ω IR = ω signal - ω idler ω idler = ω 800 - ω signal

Dépôt homogène des bactéries sur la surface Contrôle de l’adhésion bactérienne sur le support Introduction et enjeux La technique SFG L’adhésion bactérienne Les résultats Conclusion et perspectives Fluorescence : les bactéries ne sont pas naturellement fluorescentes. Coloration des bactéries avec l’orange d’acridine. 50 x 50 µm2 Dépôt homogène des bactéries sur la surface La surface d’ODT SAM est recouverte de 60 ± 10 % de bactéries.

La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG) Principe : Ep ω1 milieu non linéaire ω2 ω3 = ω1 + ω2 ω3 ω2 ω1 3 cas existent Energie A : AsGa B : ODT/Au C : CO/Pt

SFG ω (cm-1) Air Eau