Terminale STL Année 2013/2014 Guillaume Gaouyer David Kazwini Diane le Vaillant Le fromage Comment peut on vérifier la présence de Staphylococcus aureus dans le fromage frais ?

Sommaire 2 Introduction 1. L’élaboration de notre sujet 1.1 Choix du groupe 1.2 Mise en place du sujet 2. Nos recherches 2.1 Immunologie 2.2 Staphylococcus aureus 3. Les activités technologiques 3.1 Notre protocole 3.2 Comment se sont déroulé les activités technologiques 3.3 Exploitation des résultats 3.4 Cohérence des résultats par rapport à notre problématique 4. Remédiation et recherches 5. Annexe : Les différentes techniques utilisés 6. Bilan général sur le projet p.3 p.4 p.4 p.5 p.6 p.7 et 8 p.9 p.10 et 11 p.12 p.13 p.14 2

Introduction En début d’année, nous a été présenté le thème central de notre année de Terminale :le projet . En effet dans le cadre des Biotechnologies, nous devons trouver une problématique sur le thème de notre choix et élaborer des activités technologiques afin d’y répondre. Après le choix des groupes (étape périlleuse si le groupe n’est pas compétant ou s’il y a une mauvaise entente). L’étape suivante était le choix d’un sujet pertinent qui puisse nous intéresser toutes les trois. Nous nous sommes finalement orientés vers le thème de la microbiologie et plus particulièrement sur la question des Staphylocoques dorés dans l’alimentation. Effectivement dans l’alimentation des Staphylocoques sont très souvent apportés par un manque d’hygiène du personnel, c’est pourquoi la recherche de cette bactérie permet de détecter des défaut de fabrication, soit s’il s’agit d’un critère d’hygiène. De plus, dans le règlement (CE) n°2073/2005,la limite de Staphylocoques aureus acceptée dans un fromage au lait crus est de 10 ufc/g, si ces résultats ne sont as satisfaisants alors le lot de fromage doit faire l’objet d’une recherche des entérotoxines staphylococciques . Notre problématique est la suivante : « Comment peut –on vérifier la présence de Staphylococcus aureus dans le fromage frais ? » Nous allons étudier tout d’abord l’élaboration de notre sujet , puis nos différentes recherches, ensuite nous pourrons étudier nos différentes activités technologiques qui ont permis de répondre ou non à notre problématique , de plus nous verrons les remédiations avec notre laborantine, quelques annexes et enfin le bilan général de notre projet. 3

1. L’élaboration de notre sujet 1.1Choix du groupe La constitution du groupe n’a pas été très compliqué , en effet nous sommes tous les trois intéressés par tout ce qui touche à l’agroalimentaire et à la microbiologie , c’est un sujet qui peut arriver à n’importe quel moment , car les intoxications alimentaires sont des évènements que l’on ne doit pas prendre à la légère car celles-ci doivent être déclarées auprès des responsables de la santé publique afin de rechercher la cause, de limiter l’épidémie, de prévenir les récidives et de prendre les mesures spécifiques. De plus ce qui nous a surtout poussé à se mettre ensemble c’est entre autre notre bonne entente et notre goût pour répondre à des questions que nous nous posons au quotidien . En effet grâce à cela nous avons pu correctement établir les étapes de notre projet . Toute fois nous avons rencontrer quelques difficultés lors du choix du sujet . 1.2Mise en place de notre sujet Nous avons tout d’abord travaillé sur le vin car nous voulions étudier les effets bénéfiques que le vin peut avoir sur le corps humain et en particulier sur le système cardiovasculaire .Mais étant donné la complexité du sujet nous nous sommes dirigé vers un autre thème . En effet nous avons pensé à travailler sur un produit alimentaire qui est le roquefort (où sa moisissure est Penicillium roqueforti) . Nous avions mis en place une problématique qui était :"quelle est la cinétique de la moisissure du roquefort ? ».En effet nous avons voulu étudier plus précisément les moisissures de ce fromages , mais malheureusement nous n’avions pas le matériel requis pour effectuer ces manipulations. A partir de cela nous avons donc penser a chercher un autre fromage, qui était le fromage de chèvre frais où l'on suspecté des staphyloccoques à sa surface . La problèmatique qui correspond plus a ce fromage est la suivante « Comment vérifier la présence de staphylococcus aureus dans le fromage frais ? » 4

5 2. Nos recherches 2.1 L’immunologie Afin de réaliser notre test d’immunologie nous avons tout de même effectuer de nombreuses recherches à propos du complexe antigène/anticorps: Antigène : un antigène est une molécule ou cellule étrangère à l'organisme . Elle est donc considéré comme du non sois . Elle est capable de déclencher une réponse immunitaire Anticorps :Un anticorps est une molécule biologique impliquée dans l’immunité . Lien avec le protocole L'objectif de notre TP est de prouver que la classe est victime d'une intoxication alimentaire dû au fromage frais. Nous utiliserons la gélose Baird Parker qui est une gélose spécifique a cette bactérie. Pour cela nous allons donc réaliser un prélèvement sur ce fromage et nous feront un isolement de celui ci sur la gélose. Nous attendront 24 à 48h, Si staphylococcus aureus s'est développé alors nous pourrons effectuer la suite de notre identification bactérienne . 5

2.2 Staphylococcus aureus habitat: ubiquitaire , saprophyte et commensale Pouvoir pathogène: Staphylococcus aureus communément appelée staphylococcus doré est l’espèce la plus pathogène . Elle sécrète des enzymes qui attaquent les tissus et facilitent son invasion . elle sécrète également des toxines qui peuvent être responsables d’infections cutanées ou de troubles digestifs sévère c’est pourquoi on parle d’entérotoxines . C’est aussi une bactérie opportuniste La contamination du lait : elle est presque toujours manuportée , elle passe d’une mamelle externe à une autre par le matériel ou les mains . Le rôle des porteurs sains (nez, gorge ) est déterminant . Dans les bio-industries; l’hygiène doit être rigoureuse ( paire de gants et masque) . Staphylococcus aureus se multiplie lors des différentes étapes de fabrication de fromage . morphologie : coques GRAM positive , immobile le milieu d’isolement: Baird Parker Lien avec le protocole Etant donné que l’objectif de nos activités technologique est de prouver que la classe a été victime d’une intoxication alimentaire , les recherches sur staphylococcus aureus , nous on permis alors de mettre en place alors de nombreuses activités, en autre pour faire toute les étapes de l’indentification bactérienne . En effet la première étape de l’identification bactérienne a été d’ensemencer notre fromage frais sur la gélose Baird Parker. Ensuite il a fallu effectuer de nombreux test tel que la catalase , un test d’agglutination et enfin un test de la coagulase. Pour finir toute notre démarche d’identification nous avons finis par une galerie API STAPH 6

3. La mise en place de nos activités technologiques 3.1 Notre protocole D’après notre problématique nous avons voulu mettre en place un scénario pour contextualité la recherche de l’absence de staphylocoques aureus dans le fromage frais . Le scénario est le suivant : Pour trouver la cause de cette intoxication alimentaire nous avons donc réaliser plusieurs expériences qui sont : « Nous sommes dans une classe de Terminale STL de 26 élèves , il est 12h quand tous les élèves vont manger à la cantine . Deux ou trois heures après avoir mangé 9 personnes ne se sentent pas bien. Le médecin qui les prends en charge, les interroges sur ce qui pourrait être la cause de ce problème .En écoutants les élèves parler ,le médecin ce rend compte qu’ils ont tous mangé la même choses soit du fromage frais, : s’agit t-il d’une intoxication alimentaire ? Le spécialiste décide d’envoyer des échantillons prélevés sur l’ensemble des plats qu’ils ont pris pour le déjeuner à un laborantin agroalimentaire afin de faire une étude microbiologique et une étude immunologique suite à une suspicion de staphylocoques . » Partie 1 : Ensemencement par la méthode des cadrans Partie 2 : Identification Bactérienne Partie 3 : Test d’immunoprécipitation 7

Nom du test Rôle Photo Baird Parker Milieu d’isolement utilisé pour mettre en évidence S.Aureus dans les produits alimentaires. En effet S.Aureus présente un aspect caractéristique en 24h sur ce milieu : colonies noires brillantes, entourées d’un halo clair de 2 à 5 mm de diamètre Catalase Ce test est important pour la première orientation dans l’identification bactérienne. Pour effectuer l’identification complète d’une bactérie il faut connaitre le type respiratoire. Pastorex STAPH C’est un test de d’agglutination sur lame permettant l’identification rapide de Staphylococcus aureus. Coagulase La coagulase est généralement présente chez les staphylocoques pathogènes, principalement staphylococcus aureus lors de la mise en contact de la souche avec le plasma, on observe l’apparition du coagulation. Galerie API 20 STAPH C’est un ensemble de petites cupules permettant l’identification de micro-organismes par la réalisation rapide et facile de test biochimiques. Ce test peut être suivi d’une identification par logiciel de la bactérie spécifique. 8

9 3..2Comment se sont déroulés les activités technologiques ? Pour effectuer les activités technologiques nous avons fait le choix de faire réaliser nos activités technologiques par le groupe classe . Nous avons fait ce choix aussi afin d’obtenir plus de résultats pour pouvoir avoir le plus de chance de trouver quelque chose de cohérent avec notre problématique . Dans l’ensemble , les activités technologiques se sont relativement bien passées, le groupe classe a été très sérieux pour effectuer la mise en œuvre de l’identification bactérienne . Ils nous ont aussi posés de nombreuses questions qui ont permis l’avancée de notre projet en effet il y avait de nombreuses étapes de notre identification qui étaient nouvelles pour le groupe classe ( tel que le test d’agglutination , de coagulase ect) et de nombreuses recherches afin d’y répondre . De plus , certains ne comprenant pas toujours les étapes de notre démarche , nous ont permis de perfectionner notre protocole afin que celui –ci soit plus compréhensible pour tout le monde . De plus , le fait de prendre en main l’ensemble de classe et de devoir gérer les situations imprévus durant l’application du protocole nous a permis d’acquérir plus de maturité , c’est à dire qu’il faut savoir répondre aux questions et aux attentes de tous mais à la fois de manipuler en même temps , car le fait d’avoir voulu faire effectuer la manipulation à l’ensemble de la classe est simplement dans le but que ceux-ci puissent comprendre notre démarche et nous aider à l’élaboration aussi de notre projet . Sachant que pour toute la partie de l’identification nous avons dû faire bien attention a respecter toutes les question de sécurité car nous avons travaillé autour de la Microbiologie . C’est à dire qu’il fallait bien rester en milieu stérile et bien sur s’équiper des EPI ( Equipements de protections individuels ) et des EPC (Equipements de protections collectifs) . 9

10 3.3 Exploitation des résultats Groupes Pastorex STAPH Catalase Coagulase Galerie API 20 STAPH Groupe 1 Agglutination positive Positive ( présence de bulles d’oxigène) négative Staphylococcus xylosus Groupe 2 Staphylococcus micrococus Groupe 3 Staphylococcus xylosus Groupe 4 Groupe 5 Groupe 6 Quelques photos de nos résultats l’ensemencement du fromage frais sur GN et Baird Parker par la technique des cadrans : Le test d’agglutination Pastorex Staph : 10

- La galerie API 20 STAPH 11 Le test de la catalase : Le test de la coagulase : - La galerie API 20 STAPH 11

12 3.3 Cohérence des résultats avec notre problématique Rappelons que notre problématique est la suivant : « Comment peut-on vérifier la présence de Staphylococcus aureus dans le fromage frais ? » Grâce aux nombreuses étapes que nous avons effectué pour en venir à la conclusion qu’il n’y a pas de staphyloques aureus dans notre fromage en effet , la majorité de la classe a pu trouver grâce à un logiciel d’identification bactérienne sur internet qu’il y avait des staphylocoques xylosus . C’est pourquoi nous avons pu alors tourner nos recherches vers cette bactérie « Staphylococcus xylosus «  qui est une bactérie commensale de la peau . Cette bactérie est utilisée comme ferment pour la fabrication des produits carnés et laitiers. Elle joue un rôle important dans le processus de fermentation produisent des entérotoxines et peuvent de ce fait présenter un risque pour le consommateur. D’autres souches de S. xylosus sont pathogènes opportunistes pour l’animal . Des souches de S.xylosus sont isolées d’infections nosocomiales . 12

4. Remédiations et recherches avec la laborantine Notre laborantine nous a beaucoup aidé dans notre démarche scientifique , en effet elle a pu nous conseiller en ce qui concerne par exemple le matériel que nous voulions utiliser. C’est avec elle aussi que nous pu effectuer notre test d’Ouchterlony que nous ne pouvions effectuer en cours avec l’ensemble de la classe en vue du peu de temps qui nous était accordé pour les activités technologiques. De plus c’est avec elle que nous avons pu aborder les coûts du matériel que nous avons utilisé , bien évidement la plupart du matériel était déjà dans notre laboratoire car nous avons la chance d’être relativement bien équipés dans notre laboratoire . Nous avons alors commandé: Matériel utilisé Prix Gélose Baird Parker 50.00 euros Plasma de lapin 15.43 euros Bouillon cœur cervelle 16.09 euros Fromage frais 1.81 euros Kit Ouchterlony 69.95 euros Kit slidex staph plus 77.02 euros Galerie API STAPH 155.36 euros 13

6. Bilan général de notre projet Nous pensons que cette expérience nous a beaucoup enrichi, surtout au niveau du travail de groupe . Ce projet nous le considérons vraiment comme notre travail , nos idées, nos recherches ainsi que toute notre démarche scientifique qui a pu mettre sa mise en œuvre depuis le début de l’année. Durant ces quelques mois , nous avons vraiment travaillé sur ce projet et qui aujourd’hui représente bien notre vision des choses c’est pourquoi nous sommes très heureux d’avoir pu le réaliser . Notre sujet nous a permis de toucher de nombreux domaines scientifiques concernant par exemple l’immunologie , de différentes bactéries, et de nouvelles techniques pour les manipulations. De manière général, nous pensons que ce projet dans le cadre des Biotechnologie est un très bon moyen pour apprendre à travailler en groupe, c’est une expérience enrichissante dont on aura sûrement besoin à l’avenir. Nous avons travaillé avec beaucoup de plaisir sur notre sujet , mais cependant nous aurions apprécié quelques semaines de plus. Nous dressons tout de même un bilan très positif de cette expérience que nous n’hésiterions pas à renouveler . 14