LEVY Nicolas La reconnaissance de l’ADN cytosolique active une réponse de l’immunité innée dépendante de IRF3 Immunity 2006

INTRODUCTION: voies principales impliquées dans la reconnaissance mirobienne Production de cytokines: TRIF IRF3 TLR3 TLR4 TLR5 TLR1-2-6 Ds RNA LPS flagelline peptidoglycane MYD88 NF-κB TLR 9 TLR 7 ou 8 Cpg DNA ss RNA NOD 1-2 RIP RIG/Mda IFR3 NOYAU ENDOSOME MILIEU INTRACELLULAIRE Interleukines: IL-1 à IL-15 Chemokines: TNF TGF Interféron: type I : IFN α, β type II : IFN γ MILIEU EXTRACELLULAIRE

INTRODUCTION: listeria monocytogenes -- Bactérie gram-positive -- bactérie invasive -- mode d’action: LLO

INTRODUCTION: legionella pneumophila -- bactérie gram négatif --bactérie non invasive -- mode d’action: grâce aux protéines de sécrétion de type IV la bactérie éjecte de l’ADN et des protéines pour modifier le comportement de la cellule

L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? Utilisation de macrophages double KO: -- MyD88/TRIF (M/T) (aucune voie de signalisation TLR) --MyD88/RIP2 (M/R) (aucune voie de signalisation TLR et NOD) CONCLUSION: étude de la production de cytokines par les macrophages suite à une infection par listeria à l’absence de ses voies de signalisation.

la production de cytokines est elle identique dans le contexte mutant? L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? la production de cytokines est elle identique dans le contexte mutant? Figure 1: PCR quantitative des ARNs de IFN-ß, IL-6 et KC dans des macrophages WT et DKO RESULTATS:-- la production de IFN-ß et de IL-6 reste intact dans le cas des DKO. -- la production de KC diminue pour M/R mais reste intact pour M/T. -- mêmes résultats in vivo CONCLUSION: Les voies de signalisation NOD et TLR n’influent pas la production de IFN ß et IL-6 dans les macrophages infectés WT et DKO

L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? Est ce que le matériel d’une cellule de mammifère peut impliquer la même réponse que la listeria? Figure 2: Mesure de la quantité par PCR Q d’ARN IFN ß provenant de macrophages M/T activées par des thymocytes apoptotique M/T + LLO RESULTATS: IFN ß augmente en présence du matériel cellulaire de mammifère lorsqu’il a la capacité de passer dans le cytosol du macrophage. CONCLUSION: le ligand présent dans le cytosol activant la transcription d’IFN ß est commun aux cellules mammifères et aux bactéries de la listeria

L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? Les acides nucléiques seraient ils un candidat à la production des interférons des macrophages infectés par la listeria? Figure 3: PCR Q des ARN de IFN ß et IL 6 provenant de macrophages DKO transfectés avec des extraits de listeria traités ou non avec de la RNase ou DNase RESULTATS: la quantité d’ARN de IFN ß et de IL-6 n’augmente pas après un traitement à la DNase. Il y a donc une perte de la capacité de la listeria à induire une réponse aux cytokines. CONCLUSION:L’ADN est un ligand majeur indépendant du TLR et de RIP

Que se passe-t-il avec une autre bactérie telle que la legionella? L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? Que se passe-t-il avec une autre bactérie telle que la legionella? Figure 4: Observation de la transcription de IFN ß et IL6 (A) des macrophages M/T soit WT soit Dot A -/- infectés a différentes doses (B) des macrophages M/R soit WT soit Dot A-/- soit icmW-/- RESULTATS: L’absence de DotA n’implique pas une augmentation des cytokines . IcmW ne joue aucun rôle dans la production des cytokines CONCLUSION: la sécrétion de type IV est un facteur nécessaire à l’induction de production de cytokines donc à une réponse immunitaire

Que se passe-t-il avec une autre bactérie telle que la legionella? L’ADN cytosolique de la listeria est il un ligand activant les interférons des macrophages? Que se passe-t-il avec une autre bactérie telle que la legionella? Figure 5: PCR Q des ARN de IFN ß et IL 6 provenant de macrophages DKO traité au Chloramphenicol et infecté avec la legionella RESULTATS : En l’absence de synthèse de protéines bactériennes et en présence de sécrétion de type IV intacte la sécrétion de cytokines est inchangée CONCLUSION: Le seul produit inducteur restant est l’ADN

Expérience avec différents types d’ADN synthétiques (outils) Est ce que la détection de cet ADN intracellulaire est indépendant de la séquence et requiert un squelette de sucre et phosphates spécifiques? Expérience avec différents types d’ADN synthétiques (outils) ADN utilisés: ISD: -- séquence de 45 pb -- sans CpG : ISD reverse : exactement la séquence inverse de ISD : une séquence de 132 pb : une séquence CpG Lignées cellulaires: cellules dendritiques: plasmacytoide (Flt3-L) conventionnel (GM-CSF) : macrophages : fibroblaste embryonnaire (MEFs) Mutants: Simple KO: MyD88, TRIF, TLR9, RIP2, IRF3 Double KO: MyD88/TRIF

Expérience avec différents types d’ADN synthétiques Est ce que la détection de cet ADN intracellulaire est indépendant de la séquence et requiert un squelette de sucre et phosphates spécifiques? Expérience avec différents types d’ADN synthétiques Figure 6: Détection par ELISA (A et B), par PCRq (C et D) des INF de type I dans différentes lignées cellulaires transfectées avec de l’ADN

Expérience avec différents types d’ADN synthétiques Est ce que la détection de cet ADN intracellulaire est indépendant de la séquence et requiert un squelette de sucre et phosphates spécifiques? Expérience avec différents types d’ADN synthétiques RESULTATS :L’induction d’IFN de type 1 par ISD est équivalente dans tous les types cellulaires et de manière indépendante de Myd88, TRIF ou RIP2. Ces résultats sont retrouvés dans l’induction d’IFN de type 1 par ISD reverse. En revanche, il y a absence d’induction pour le KO IRF3. CONCLUSION: ces inductions par ADN purifié reproduisent les réponses de la listeria de manière séquence indépendante mais IRF3 dépendante.

Est ce que la détection de cet ADN intracellulaire est indépendant de la séquence et requiert un squelette de sucre et phosphates spécifiques? Le squelette de sucre d’ADN est t il nécessaire à la production de cytokines? B Figure 7: RT-PCR Q de l’ARN de IFN provenant de macrophages transfectées a) avec de l’ADN ligand b) Avec de l’ADN ligand et traité à la chloroquine RESULTATS: ISD-pthio n’implique aucune augmentation de cytokines. En présence de chloroquine les CpG n’induisent pas une production de cytokines CONCLUSION: Les sucres sont importants pour la reconnaissance du signal. ISD est reconnu dans le cytosol et non l’endosome.

Est ce que NF-κB est pésente dans la voie d’activation de ISD? Est ce que l’activation de IFN-β par l’ADN intracellulaire est indépendant de NF-κB et MAP-Kinase ? Est ce que NF-κB est pésente dans la voie d’activation de ISD? Figure 8: Comparaison de l’activation NFKB dans les macrophages traités avec ISD ou avec LPS RESULTATS :pas de signal des éléments du complexe NFKB dans le cas de l’induction de IFN type I par ISD CONCLUSION:La production du IFN ß du à ISD ne dépend du complexe NFKB

Est ce que MAPK est présente dans la voie d’activation de ISD? Est ce que l’activation de IFN-β par l’ADN intracellulaire est indépendant de NF-κB et MAP-Kinase ? Est ce que MAPK est présente dans la voie d’activation de ISD? Figure 9: Comparaison de l’activation des MAP K en réponse au Traitement ISD ou CpG RESULTATS :Le traitement par ISD n’active aucunes MAPK CONCLUSION : Le dbDNA et le dbRNA activent deux voies de signalisation distinctes

Récapitulation et présentation des dernières expériences Est-ce que la reconnaissance du DNA intracellulaire active un programme d’expression de gènes unique ? Récapitulation et présentation des dernières expériences Utilisation de puces à ADN pour la comparaison des programmes d’expression des gènes activés par les 3 voies (ISD, TLR9, et RIG-1/MDA5) : (1) Dans CDs : Réponse ISD (reconnaissance du DNA dans cytosol) comparée à une réponse TLR9 (reconnaissance du DNA dans endosomes) (2) Dans les macrophages MyD88/Trif DKO (pas de reconnaissance par les TLRs notamment les TLRs endosomaux) Réponse ISD une réponse RIG-1/MDA5 (reconnaissance du dsRNA dans cytosol ici mimé par Poly I : C)

(1) Stimulation des cellules dendritiques par ISD ou CpG Figure 10: (1) ISD et CpG (réponse TLR9) permettent la maturation CDs

(1) Induction génique par deux expériences différentes Analyse par puce à ADN des ARN totaux des DCs (1) Figure 11: RESULTATS:ISD induit spécifiquement IFN type I (anti viral) CpG induit spécifiquement KC (Chemokine) ISD et CpG induisent IL6 (Pro inflammatoire) CONCLUSION:Réponses superposées et gènes uniques

(1) Figure 12: Etude de l’expression de gènes en présence ou absence du IFNαR1 suite à une induction par ISD RESULTATS:L’induction IFN ß est seulement légèrement diminuée, toutes les autres réponses (secondaires) nécessitent donc l’activation du IFNRα1 -IRF7- CONCLUSION:Démonstration de la présence de 2 programmes distincts

Est-ce que la reconnaissance du DNA intracellulaire active un programme d’expression de gènes unique ? Utilisation de puces à ADN pour la comparaison des programmes d’expression des gènes activés par les 3 voies (ISD, TLR9, et RIG-1/MDA5) : (1) Dans CDs : Réponse ISD (reconnaissance du DNA dans cytosol) comparée à une réponse TLR9 (reconnaissance du DNA dans endosomes) (2) Dans les macrophages MyD88/Trif DKO (pas de reconnaissance par les TLRs notamment les TLRs endosomaux) Réponse ISD une réponse RIG-1/MDA5 (reconnaissance du dsRNA dans cytosol ici mimé par Poly I : C)

(2) Analyse par puce à ADN des ARN totaux des macrophages M/T Induction génique par deux expériences différentes (2) Figure 13: Étude d’expression des gènes dans les macrophages M/T suite à une induction par ISD ou poly I:C CONCLUSION: la réponse est similaire pour l’IFN type I et gènes induits par IFN en réponse secondaire

(2) Analyse par puce à ADN des ARN totaux des macrophages M/T Induction génique par deux expériences différentes (2) Figure 14: Changements dans les transcrits après 3 heures RESULTAT: -(RIG-1/MDA5 active MAP K pas ISD) Le facteur de transcription Egr1 inductible par MAP K est seulement induit par Poly I : C -Mafb réduit après ISD -RhoE augmenté après ISD CONCLUSION: La réponse dépend donc du type d’acide nucléique détecté

Conclusion La voie ISD est une nouvelle voie de signalisation de reconnaissance d’ADN microbien cytosolique. Les trois voies: ISD, TLR et RIG1/MDA5 sont capables de reconnaître apparemment tous les motifs à acide nucléique. 3 dsRNA, poly I:C 7 ssRNA 8 9 CpG DNA non méthylé TLR endosome PPR des acides nucléiques RNA hélicase RIG1 ssRNA 5’P Cytoplasmique MDA5 dsRNA viraux LGP2 ISD ? dsDNA cytoplasmique

Perspectives Cependant il reste à connaître les détails de la voie ISD: la nature du senseur pour le DNA discrimination entre entre le soi et le non soi