Déterminisme du sexe Aspects moléculaires et pathologie Pr Jean Pierre Siffroi Service d’Histologie, Biologie de la Reproduction et Cytogénétique Hôpital Tenon, Paris jean-pierre.siffroi@tnn.aphp.fr

et d’organes génitaux externes appropriés Définitions - La détermination sexuelle: est la voie de développement qui conduit à la formation d’un testicule ou d’un ovaire, constituant ainsi le sexe gonadique. La différenciation sexuelle : est le processus qui garantit le développement d’un tractus génital et d’organes génitaux externes appropriés en fonction du sexe gonadique, constituant alors le sexe phénotypique

Déterminisme sexuel Différenciation sexuelle Sexe génétique ou chromosomique Déterminisme sexuel Sexe gonadique Différenciation sexuelle Sexe phénotypique Sexe psychique

Sexe génétique XY XX Y X X XY XX

Sexe gonadique Origine des cellules germinales Dans les deux sexes, les cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells: PGCs) apparaissent dans la paroi postérieure de la vésicule vitelline et MIGRENT vers la région du mésonephros (rein intermédiaire) pour former les crêtes génitales: future gonade primitive indifférenciée Vésicule vitelline PGCs Intestin postérieur Intestin antérieur Coeur Cloaque Mésonephros Crêtes génitales Intestin

La différenciation gonadique est plus précoce et plus rapide dans le sexe masculin que féminin Involution de la région corticale de la gonade indifférenciée développement de sa région médullaire. Les cellules de Sertoli empêchent les CG de se multiplier et d’entrer en méiose. Entre les cordons séminifères d’autres cellules mésenchymateuses se différencient en cellules interstitielles de leydig qui assurent la sécrétion de testostérone (sécrétion endocrine testiculaire). Les testicules se différencient dans l’abdomen puis migrent à partir de la fin du 3ème mois vers le canal inguinal qu’ils franchissent pour se loger dans les bourses où ils se trouvent normalement à la naissance.

Dans le sexe mâle, la différenciation de la gonade primitive en testicule aboutit à la formation de tubes séminifères primitifs (PGCs et cellules de Sertoli) dans lesquels les PGCs vont bloquer leur maturation au stade de futures cellules souches de la spermatogenèse PUBERTE Reprise de la maturation des cellules germinales Spermatogenèse ou production de gamètes matures continue tout au long de la vie

La différenciation ovarienne involution des cordons sexuels primitifs formation d’une deuxième génération de cordons sexuels dans la région corticale de la gonade indifférenciée . constitution d’un stock non renouvelable de cellules germinales, après une phase de multiplication massive qui entrent en méiose mais ne parviennent pas à l’achever. Les cellules folliculaires dérivent des cordons de deuxième génération entourent les cellules germinales et forment les follicules ovariens.

Dans le sexe femelle, les PGCs rentrent en méïose, ne la terminent pas et se bloquent au stade de follicule primordial PGC Migration Invasion de la gonade primitive Ovaire Début de la méïose au stade foetal Blocage avant la naissance en fin de prophase de M1: stade dyctiotène, follicule primordial Reprise de la méïose à la puberté

La différenciation gonadique entraîne celle du tractus génital: sexe mâle: - disparition du canal de Müller - développement du canal de Wolf en épididyme et déférents - descente testiculaire dans le scrotum sexe femelle: - disparition du canal de Wolf Müller en trompes, utérus et partie supérieure du vagin

La différenciation des voies génitales est hormonodépendante et induite par le testicule foetal Expériences d’Alfred Jost: - évolution par défaut vers la différenciation femelle - dualité des hormones testiculaires foetales

Expériences d’A. JOST les années 1940 - expériences sur des lapins Les gonades d’embryons de lapin ont été retirées chirurgicalement avant que celles-ci présentent les premiers signes de différenciation Tous les lapins nés après avoir été castrés ont présenté un phénotype féminin Deuxième temps - des testicules matures ont été greffés sur des embryons dont les gonades indifférenciées avaient été chirurgicalement retirées: les lapins étaient de sexe masculin

la testostérone ne provoque qu’une masculinisation Testicule greffé Cristal de testostérone Fœtus castré (XX ou XY) vagin prostate Fœtus XX Alors que le testicule entraîne masculinisation et régression müllerienne, la testostérone ne provoque qu’une masculinisation une autre hormone est responsable de la disparition des canaux de Müller Découverte de l’AMH (Anti-Müllerian Hormone)

AMH (Hormone Anti-Mullerienne): le gène est situé sur le chromosome 19 code pour une protéine de 140 Kd. Premier produit des cellules de Sertoli identifiable. Sa production est sous le contrôle de plusieurs facteurs qui se fixent sur son promoteur : SOX9, SF1, SRY, GATA4. Cette hormone déclenche alors une réponse biologique de ses cellules cibles par l’intermédiaire de deux récepteurs trans-membranaires (type I et II) entraînant la phosphorylation de protéines cytoplasmiques qui, à leur tour, vont réguler dans le noyau l’expression de gènes cibles.

L’AMH: provoque une régression rapide des canaux de Muller. Les mutations inactivatrices du gène de l’AMH ou de son récepteur de type II ont été décrites et sont responsables du syndrome de persistance des canaux de Müller. Les hommes atteints ont un phénotype masculin normal mais présentent une cryptorchidie, un utérus et des trompes.

Dans le testicule: Dans l’ovaire: 2eme type d’hormones: les stéroïdes La différenciation en terme de sécrétion endocrinienne stéroïde a lieu en même temps dans l’ovaire et dans le testicule. Dans le testicule: AMH : première hormone secrétée régression de l’appareil de Müller: premier événement de la différenciation masculine Très rapidement, différenciation des cellules de Leydig et synthèse de testostérone. Dans l’ovaire: synthèse d’oestradiol par l’ovaire dès la 8ème semaine

Testostérone: synthétisée par les cellules interstitielles de Leydig du testicule foetal. convertie en dihydrotestostérone (DHT) par la 5 alpharéductase dans certains tissus cibles. permet le développement des canaux de Wolff et des organes génitaux externes mâles (DHT). Un défaut de synthèse des androgènes entraîne un défaut de masculinisation du foetus. Les androgènes agissent par l’intermédiaire d’une protéine réceptrice dont le gène est porté par le chromosome X. Des mutations de ce gène sont responsables du syndrome d’insensibilité aux androgènes.

Quels sont les gènes impliqués dans le déterminisme testiculaire et/ou dans la différenciation sexuelle? les enseignements de la pathologie et des modèles animaux

Formule chromosomique Différenciation sexuelle Phénotype Rapports sexe génétique – sexe gonadique Formule chromosomique Différenciation sexuelle Phénotype 46 XX Féminine Femme 47 XXX 45 X0 Syndrome de Turner 46 XY Masculine Homme 47 XXY Syndrome de Klinefelter 47 XYY Disomie Y 46 XY q- Infertilité masculine 46 XY p- Dysgénésie gonadique 45 Y0 Létal

Il apparaît clairement que le chromosome Y est à l’origine du déterminisme mâle et,ce , quel que soit le nombre de chromosomes X. Le chromosome Y porte le signal génétique responsable de la différenciation de la gonade primitive en testicule, ce dernier sécrétant les hormones modifiant le tractus génital. Origine des gonosomes

Oiseaux Mammifères Reptile ancêtre commun Autosomes Z W X Y 240-320 Ma 130-170 80-130 30-50

Bras court P Bras long Q Centromère Région euchromatique du bras long 11.3 PAR1 Région pseudo-autosomale 1 PAR2 Région pseudo-autosomale 2 Bras court P Zone Non recombinante NRY 11.2 11.1 Centromère Hétérochromatine Région euchromatique du bras long 11.1 11.2 Bras long Q 12

Comment le chromosome Y induit-il le développement testiculaire? Mise en évidence du TDF (Testis Determining Factor)

SRY =TDF: facteur de détermination testiculaire L’étude génétique de sujets ayant une dissociation entre leur caryotype et leur phénotype (homme XX femme XY) a permis de préciser le segment du chromosome Y impliqué dans la différenciation sexuelle. L’effet masculinisant du Y est lié à la présence d’un facteur de déterminisme testiculaire ou TDF dont l’identification a pris de nombreuses années.

SRY Chez les mammifères, le chromosome Y joue un rôle dominant dans le déterminisme et la fonction du testicule. Le gène SRY (sex determining region, Y chromosome) est le signal primaire déclenchant la formation du testicule. Le gène SRY, constituée d'un exon unique, code pour une protéine de 204 acides aminés, d’un poids moléculaire attendu de 27 kiloDaltons (kDa).

Yp Yq SRY Preuves du rôle de SRY comme déclencheur PAR1 initial du déterminisme testiculaire: pathologie et souris transgéniques PAR1 SRY Yp Syndrome de Swyer : dysgénésie gonadique pure chez des individus 46 XY présentant un phénotype féminin normal la plupart des mutations sont situées dans cette boîte HMG, altérant ainsi la capacité de liaison à l’ADN. Preuves par les mutations ponctuelles Yq

Preuves par les modèles animaux Souris transgéniques ayant reçu le gène SRY humain: les femelles XX se développent en mâles

Les anomalies touchant SRY sont les premières on peut être mâle avec deux chromosomes X: il suffit qu’un chromosome porte SRY. Il est possible à l’inverse d’être femelle avec une formule XY: il suffit que Y ait perdu son SRY. Les anomalies touchant SRY sont les premières causes de discordance caryotype – phénotype à rechercher

Comment le chromosome Y peut-il perdre SRY? En le donnant au chromosome X! SRY PAR1 Normalement, le crossing-over obligatoire entre l’X et l’Y à la méïose survient dans la region PAR1: aucune conséquence pathologique Il en résulte un chromosome Y qui a perdu SRY et un chromosome X qui l’a gagné: discordance caryotype-phénotype SRY PAR1 X SRY+ Y SRY- SRY PAR1 En cas de crossing-over inégal (possible en raison de séquences homologues entre l’X et l’Y en aval de SRY): passage de SRY sur le chromosome X

Chez une femme XY dont l’Y possède toujours SRY: SRY peut être inactivé par une mutation et chez une femme XY- SRY+ et non muté: la discordance caryotype – phénotype peut être due à une non réceptivité des OGE à la DHT c’est l’existence ou non d’une synthèse d’AMH (utérus présent ou absent) qui fait souvent la différence

structures Mülleriennes Résistance aux androgènes 46,XY Phénotype masculin normal Phénotype féminin X Y SRY - SRY + X Y SRY muté SRY X Y SRY Dysgénésie gonadique Pas d’AMH: trompes et utérus + Testicules AMH +: Régression des structures Mülleriennes Résistance aux androgènes

Chez les hommes à caryotype 46,XX, il s’agit pratiquement toujours d’un chromosome X qui a récupéré SRY (réciproque des femmes XY SRY- par crossing over inégal) mais des situations rares peuvent se présenter!

Tableau proche du syndrome 46,XX Phénotype féminin normal Phénotype masculin SRY X SRY + 1/20000 Tableau proche du syndrome de Klinefelter SRY - X Autres gènes X

La compréhension du mode d’action d’autres gènes impliqués dans le déterminisme testiculaire passe par l’hypothèse du modèle de double répression et de l’existence du facteur Z Z SRY Activation de la voie de déterminisme testiculaire Répression Gènes de déterminisme testiculaire Si SRY est un gène « mâle spécifique » puisque porté par l’Y, les autres gènes impliqués dans le déterminisme testiculaire sont situés sur l’X ou sur des autosomes, donc présents chez la femme!

FEMME XY SRY positif non muté Gènes mâle-spécifiques FEMME XX NORMALE Z répression Gènes mâle-spécifiques HOMME XY NORMAL activation Z SRY Gènes mâle-spécifiques HOMME XX SRY négatif Z muté (mutation récessive) activation Gènes mâle-spécifiques SRYNORMAL FEMME XY SRY positif non muté répression Z muté (mutation dominante)

SOX9 et la dysplasie campomélique La dysplasie campomélique (CD) est une maladie autosomique qui consiste principalement en une angulation et une courbure des os longs, en association avec des défauts de formation des cartilages (path. chondrogenèse). La plupart des patients meurent dans l'enfance, à la suite d'une détresse respiratoire. Des mutations dans le gène SOX9 sont responsables de la CD.

Des mutations hétérozygotes (maladie autosomique dominante) Gène localisé en 17q24 Des mutations hétérozygotes (maladie autosomique dominante) sont responsables des signes cartilagineux et osseux mais dans 75% des cas, les individus XY présentent une réversion sexuelle avec un développement féminin (alors que le développement ovarien des individus XX est normal)

Si l’haploinsuffisance de SOX9 entraîne une réversion mâle – femelle, une surexpression peut-elle avoir l’effet inverse? Nouveau-né avec des organes génitaux masculins ambigus Caryotype XX présentant une large duplication du chromosome 17 incluant SOX9 (en mosaïque avec des cellules normales): premier exemple d’une réversion sexuelle non causée par SRY chez l’homme (Huang 1999) . L’expression de sox 9 suffit pour induire une différenciation des cellules de Sertoli et un développement testiculaire en l’absence de sry chez la souris (Vidal 2001). Cela confirme que SOX 9, comme SRY, est capable d’induire le développement mâle chez un individu XX.

SF1 : (steroidogenic factor 1) Localisé en 9q33 Récepteur nucléaire orphelin. Exprimé dans les cellules somatiques de la gonade indifférenciée (croissance et la différentiation des cellules somatiques. Il régule la transcription du gène de l’AMH. Plus tardivement son expression persiste dans les cellules de Leydig où il intervient dans la stéroidogenèse.

Chez l’homme Chez la femme mutation hétérozygote dans le domaine à doigts-de-zinc a été décrite dans un cas d’inversion sexuelle complète en rapport avec une dysgénésie gonadique partielle 46,XY et une insuffisance surrénalienne Chez la femme Patiente 46,XX avec une insuffisance surrénalienne mais un développement ovarien normal en rapport avec un mutation faux-sens qui élimine à la fois l’activité de liason à l’ADN et l’activité de transactivation de la protéine Ces résultats suggèrent que deux copies de SF1 sont indispensables à la formation du testicule chez l’homme, alors qu’une copie est suffisante pour le développement de l’ovaire et de la gonade bipotente

Les souris délétées du gène présentent : Chez la souris: Les souris délétées du gène présentent : une absence de développement des surrénales et des gonades (arrêt du développement des crêtes génitales à 12 jpc du développement embryonnaire suivi d’une dégénérescence apoptotique) et meurent quelques jours après la naissance les mâles présentent un phénotype interne femelle suite à la persistance des canaux de Muller (par absence d’amh sécrétée normalement par le testicule).

Région DSS et gène AHC Xp 21 DSS: Dosage Sensitive Sex reversal Délétion: syndrome des gènes contigus: Duchenne, déficit en glycérol kinase, AHC, ... Duplication: réversion sexuelle mâle femelle

DSS-AHC critical region on human X chromosome gene 1 Gène AHC DAX-1 DSS-AHC critical region on human X chromosome gene 1 Récepteur nucléaire orphelin facteur de transcription Cortex surrénalien Axe hypothalamo- hypophysaire Gonade

DAX1 réprime le développement testiculaire génotype X Y X X X Y SRY SRY DAX1 DAX1 DAX1 inactif DAX1 (2 copies) gonades testicule ovaire Dysgénésie gonadique phénotype masculin féminin féminin

Rôle de DAX? On a longtemps supposé que DAX-1 puisse avoir un rôle pro-ovarien.... mais Chez les souris invalidées pour Dax-1, le développement des ovaires s’est révélé normal Le rôle du DAX-1 a été donc circonscrit à celui de facteur “anti-testiculaire” mais la situation est plus complexe car les hommes mutés pour DAX-1 n’ont pas de réversion sexuelle mais seulement un hypogonadisme

Le déterminisme du sexe est très dose-dépendant En fait, SRY et DAX ont des effets antagonistes SRY arrive à contrebalancer DAX quand le gène est en une seule copie mais pas quand il y en a deux: réversion mâle - femelle Les souris XY transgéniques possédant deux copies de DAX ne montrent pas de réversion du sexe sauf une souche dont l’Y est « faible » Le chromosome Y humain n’est pas brillant Le déterminisme du sexe est très dose-dépendant

Une analyse histologique montre une agénésie des gonades et des reins. WT1 Oncogène développement de tumeurs rénales infantiles: tumeurs de Wilms mutations hétérozygotes de ce gène sont associées à des phénotypes variables associant à des degrés divers défauts de différenciation gonadique et néphropathies. Les souris homozygotes pour la mutation de Wt1 meurent in utero. Leurs organes génitaux sont de type féminin, quelque soit leur sexe chromosomique. Une analyse histologique montre une agénésie des gonades et des reins. Les souris meurent probablement du fait de leurs multiples anomalies, cardiaques et pulmonaires entre autres.

Chromosome 11 10 exons, 32 isoformes. Code pour une protéine en doigt de zinc (liaison à l’ADN au niveau de séquences spécifiques) Le syndrome de Denys-Drash comporte : une atteinte rénale avec néphroblastome (Tumeur de Wilms), insuffisance rénale aiguë une atteinte gonadique avec dysgénésie gonadique et ambiguïtés sexuelles de degré variable. Le syndrome de Frasier se caractérise par: néphropathie à évolution lente une dysgénésie gonadique pure (gonades réduites à des bandelettes fibreuses) qui entraîne chez les individus XY un phénotype complètement féminin.

Phénotype des souris knock-out Pathologie humaine (Mutations) WT1 GENE Locus Gain de fonction Perte de fonction Phénotype des souris knock-out Pathologie humaine (Mutations) WT1 11p15 Agénésie des reins et des gonades Syndrome Denys Drasch Syndrome de Frasier Lhx9 1q31- 32 Migration des cellules germinales préservée. Pas de gonadogenèse Aucun autre organe atteint Pas de mutations retrouvées dans les dysgénésies gonadiques humaines XY SF1 9q33 Agénésie des glandes surrénales et des gonades et de l’hypothalamus Nécessite l’atteinte de 2 allèles La mutation d’un seul allèle suffit chez l’homme Hypoplasie des surrénales DAX1 Xp21.3 Femelle XY (duplication humaine , souris transgénique) Blocage de la spermatogenèse DSS- AHC hypoplasie des surrénales, hypogonadisme. Pas de réversion sexuelle XX ni XY (Phelan JK 2001, review) SRY Yp11 Dysgénésie gonadique 46 XY Syndrome de Swyer SOX9 17q24 Dysplasie campomélique et inversion sexuelle 46 DMRT1 DMRT2 9p24 Monosomie 9p wnt4 1p35 Masculinisation des souris XX (réversion sexuelle) Inversion sexuelle insl3 19p Descente ovarienne abdominale avec formation des structures gubernaculumHernie inguinale chez les femelles Absence de descente testiculaire cryptorchidie XH2 Xq13 Nr Alpha-thalassémie/retard mental.

X DAX1 Y SRY TESTIS SF1 SOX9 WNT4 OVAIRE