Culture cellulaire : petite approche… De nombreuses erreurs ou imprécisions doivent parsemer cette présentation… Vous voudrez bien nous en excuser et ne pas hésiter à la critique ! 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

1. POURQUOI LA CULTURE CELLULAIRE ? 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

1. Pourquoi la culture cellulaire ? Les cultures cellulaires ont été réalisées pour la première fois au début du XX° siècle (1912 : Alexis Carrel). Pourquoi cultiver des cellules ? • dans un premier temps elles sont utilisées pour faire progresser la recherche fondamentale, • et ensuite elles sont utilisées dans l'industrie pour des études de toxicologie (notamment en raison des problèmes d'expérimentation animale, expérimentation animale qui ne peut malgré tout pas être supprimée car les effets sur l'animal entier ne sont pas les mêmes que sur des cellules isolées), pour les études chromosomiques (caryotype foetal), pour la production de peau neuve par culture pour autogreffe ultérieure(pour les grands brûlés), pour la production des hybridomes, pour la culture des virus (production de vaccin ou diagnostic direct ou indirect des viroses). 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2. OBTENTION DE CELLULES 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

D’où viennent les cellules ? Les cellules peuvent provenir : 1. du sang : ce sont des cellules circulantes non jointives, 2. d’organes : ce sont des cellules jointives (au moins pour les épithéliums) 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2.1. Pour les cellules circulantes : Exemple de protocole :  Diluer le sang recueilli sur héparine au 1/2 en tampon PBS  Déposer doucement 20 cm3 de sang dilué à la surface de 20 cm3 de Ficoll-Hypaque de densité exactement mesurée de 1,077 contenu dans un tube à centrifuger (à fond conique ou éventuellement à fond rond).  Réaliser pendant 30 min. une centrifugation douce (600 g - 2000 Tours par min.) Les lymphocytes se trouvent au niveau de l'anneau (du tapis) à l'interface des deux liquides. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2.1. Pour les cellules circulantes : • Aspirer doucement l'anneau et donc les cellules à l'aide d'une pipette et les laver deux fois en tube conique en tampon PBS. Pour prélever l'anneau, placer l'extrémité de la pipette juste au dessus de l'anneau et lors de l'aspiration l'anneau vient au niveau de la zone d'aspiration. puis : 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2.2. Pour les organes : Un tissu est formé d'un ensemble de cellules et éventuellement d'une matrice extracellulaire. Dans les tissus de type épithélial, les cellules sont fortement liées entre-elles. Rares sont les tissus isolés ou " purs " : ils appartiennent en général à un organe constitué d'un tissu principal et de nombreux tissus accessoires : tissus conjonctifs d'emballages, tissus des vaisseaux sanguins, neurones.... Un organe contient donc de nombreux types de cellules. La culture sera donc réalisée à partir d'un fragment plus ou moins important d'un organe. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2.2. Pour les organes : Deux méthodes :  1. utilisation d'un fragment de tissu : Les cellules se développent à partir du fragment à la surface du support baignant dans le milieu de culture.  2. fragmentation de l'organe :  le tissu est dissocié mécaniquement et enzymatiquement : on obtient une suspension de cellules que l'on peut partiellement purifier. Les enzymes utilisées sont des protéases comme la trypsine qui coupent les ponts protéiques entre les cellules. L'opération peut être faite à 4°C ou à 37°C avec quelques risques de destructions cellulaires.  les cellules sont mises en culture : c'est la culture primaire  elles sont repiquées comme en microbiologie : c'est la culture secondaire qui doit aussi passer par une étape de dissociation des cellules à la trypsine par exemple. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

2.2. Pour les organes : Culture de tissus Dissociation enzymatique ou/et mécanique du tissu en cellules Mise en culture des cellules Culture primaire de cellules repiquage Culture secondaire de cellules Nouvelle culture secondaire..... 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3. LA CROISSANCE CELLULAIRE 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3.1. Courbe de croissance Dans certains cas, la croissance se poursuit indéfiniment Log Ncellules Au bout d’une soixantaine de mitoses, deux possibilités : Soit en concentration soit en densité de surface Normalement : les cellules meurent (apoptose) Temps (semaines) 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3.2. Contrôle de la croissance cellulaire La croissance cellulaire est contrôlée : en culture cellulaire, on obtient un tapis au fond de la boîte. Quand le tapis est complet, la multiplication cellulaire s’arrête : c’est L’INHIBITION DE CONTACT. quand un organe comme la foie est partiellement enlevé, il « repousse » à la taille nécessaire pour combler le manque et non indéfiniment… il existe des facteurs protéiques accélérateurs de la croissance (ou déclencheurs), comme les facteurs de croissance des épithéliums (EGF…). en culture cellulaire, le nombre de mitoses est limité pour la plupart des cellules : elles apoptosent… En lien, la disparition des télomères. Télomères : Ce sont les terminaisons des chromosomes formées des seules liaisons TTAGGG (Thymine, Adénine, Guanine). À chaque multiplication cellulaire, on constate un raccourcissement progressif des télomères et au bout d'un certain nombre de divisions (40 environ) on constate une dégénérescence de la cellule et sa mort. La télomérase permet la réparation des télomères et leur maintien à leur longueur initiale. Le vieillissement et la mort, c'est le sort de la plupart des cellules du corps humain qui ne synthétisent pas de télomérase pour réparer les télomères. La télomérase est une transcriptase inverse liée à un RNA matrice. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3.2. Contrôle de la croissance cellulaire 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3.2. Contrôle de la croissance cellulaire (bilan) La croissance cellulaire est donc finement contrôlée : il existe des gènes activateurs, des gènes freins. De plus peuvent intervenir l'apoptose et la limitation du nombre possible de mitoses par suppression progressive des télomères. Quatre types de gènes au moins interviennent dans le contrôle de la multiplication cellulaire mis en défaut dans le processus cancéreux :  gènes accélérateurs codant pour des facteurs de croissance cellulaire, dits protooncogènes : leur activation conduit à la stimulation directe ou indirecte de la croissance cellulaire contrôlée par la cellule ou son environnement. Ce peut être des gènes codant par exemple pour un récepteur de facteur de croissance cellulaire comme l'EGF (Epithélium Growth Factor) ou des gènes de kinases ou de phosphorylases intermédiaires (en particulier tyrosine kinases) ou des protéines G ou des protéines nucléaires (facteurs de transcription, protéines régulatrices). Leur mutation en oncogènes (onco = masse) est une première étape possible vers le cancer. L'oncogène est le gène dérégulé. Dans le cas du récepteur à l'EGF, il peut être activé en permanence, même en l'absence de l'EGF. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

3.2. Contrôle de la croissance cellulaire (bilan) gènes freins inhibant la multiplication cellulaire dits suppresseurs de tumeurs : les protéines produites, comme la p53, inhibent au contraire la multiplication cellulaire. Leur mutation va supprimer l'inhibition et donc laisser la place possible à la multiplication anarchique des cellules. 50% des cellules cancéreuses montrent une mutation du gène de la p53. gène de la télomérase, enzyme qui répare les télomères. En effet, lors de la mitose, les extrémités de chaque molécule de DNA vont être amputées d'un certain nombre de télomères. Au bout d'un certain nombre de suppressions, la cellule ne peut plus se multiplier et meure par apoptose (suicide cellulaire ou mort cellulaire programmée) ou reste dormante. Ce gène est actif dans les cellules souches du sang et dans les cellules sexuelles au moins. Il est évidemment indispensable qu'il soit fonctionnel dans les cellules cancéreuses qui sinon arrêteraient leur multiplication au bout d'un certain nombre de mitoses. gènes de déclenchement de l'apoptose dont l'inhibition rend les cellules insensibles au signaux d'apoptose. . … 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

cellule transformée 3.3. Transformation L’insertion génomique du virus provoque des modifications des contrôles cellulaires de la croissance. VIRUS (par ex. : Epstein Barr ou HHV5) Plasmide exprimant la « telomerase reverse transcriptase protein (TERT) » cellule transformée L’expression de la télomérase permet la reconstitution des télomères, assurant l’immortalisation. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Vocabulaire : • Lignée semicontinue = Lignée obtenue par culture secondaire de cellules fibroblastiques embryonnaires : le nombre de repiquages est limité à environ 50. • Lignée continue = Lignée cellulaire obtenue à partir de tumeurs malignes, de cellules transformées par un virus (ou naturellement) : le nombre de repiquages est théoriquement infini. • Cellules souches = Cellules « totipotentes » comme la cellule œuf. Il semble exister plusieurs niveaux de totipotence… Peut être peut-on estimer que les cellules souches sont des cellules transformées naturelles capables de différenciation ? • Culture primaire = Culture réalisée à partir d’un organe. Elles conservent en général les caractéristiques originelles. • Culture secondaire = Culture réalisée à partir d’une culture primaire. Le nombre de passages est limité : environ 3 pour les cellules épithéloïdes, environ 50 pour les cellules fibroblastiques embryonnaires 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Vocabulaire : • Lignée semicontinue = Lignée obtenue par culture secondaire de cellules fibroblastiques embryonnaires : le nombre de repiquages est limité à environ 50. • Lignée continue = Lignée cellulaire obtenue à partir de tumeurs malignes, de cellules transformées par un virus (ou naturellement) : le nombre de repiquages est théoriquement infini. • Cellules souches = Cellules « totipotentes » comme la cellule œuf. Il semble exister plusieurs niveaux de totipotence… Peut être peut-on estimer que les cellules souches sont des cellules transformées naturelles capables de différenciation ? 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Exemples de lignées cellulaires Les lignées classiques utilisées dans les laboratoires sont par ex :  cellules Hela provenant d'une tumeur utérine de Mme Henrietta Lacks décédée en 1951 (lignée continue), en culture depuis 1952…  cellules KB provenant d'un carcinome oral humain (lignée continue ?)  cellules 3T3 provenant d'un embryon de souris (lignée semi-continue ?).  cellules Véro cellules épithéliales de rein de singe Cercopithecus aethiops, singe vert africain (lignée continue)  cellules MRC-5 provenant de poumons de foetus humain (lignée semicontinue) 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

MRC5 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

4. LA CONSERVATION DES CELLULES 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

4. Conservation Conservation : Le DMSO protège les membranes lysosomiales et empêche le relargage des protéines. Conservation : On congèle, en présence de cryoprotecteur (diméthylsulfoxyde = DMSO). une suspension de 4 millions de cellules par mL en phase exponentielle à -40°C lentement (1-4°C par min) puis dans le diazote liquide (-196°C). La décongélation est rapide à 37°C. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

5. PROBLÈMES DE SÉCURITÉ 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

5. Sécurité Sécurité : Problème des cellules Les cellules cultivées peuvent être d’origine humaine. On peut toujours craindre un transfert de DNA de la culture vers l’opérateur ! (il faudra alors interdire tout rapport humain !). Dans le cas de cellules transformées par un virus, on peut craindre son transfert.  Problème des cultures de virus Quand on cultive des virus d’origine humaine on obtient des quantités importantes de virus. S’il est vaccinal il n’y a peu de raisons de s’inquiéter. S’il est pathogène (genre Herpès), il y a lieu de se poser des questions ! Au niveau scolaire, il est prudent (même en absence de textes) d’éviter de telles manipulations ou de faire dans des conditions de sécurité importantes. Dans le domaine de la législation, il faut tenir compte des textes MAIS aussi de l’interprétation du juge qui pourrait considérer que le risque pris est excessif et donc condamnable, même si la manipulation est légale ! 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Fiche 2 (origine INSERM) Les cultures cellulaires : Critères d’évaluation des risques  L’origine des cellules : végétale, animale ou humaine. La nature : • cellules libres ou circulantes (cellules sanguines), • cellules provenant d’un tissu, d’un organe, • cellules saines ou tumorales ou infectées ou transformées ou transfectées. Le type de culture cellulaire : • culture primaire (nombre réduit de divisions) : le risque majeur est celui associé à l’existence d’agents infectieux, • culture de lignées cellulaires (durée de vie indéfinie) : elles proviennent de tumeurs spontanées ou de cellules transformées par immortalisation, • culture de cellules transfectées. Le mode d’immortalisation (cas des cellules transformées) : • par un oncogène, • par un virus (polyome, SV40, virus du sarcome de Rous, virus d’Epstein-Barr…), • par un produit chimique tel qu’un agent mutagène (nitrosoguanidine, méthanesulfonate d’éthyl…). Le risque lié à la culture de cellules immortalisées est donc lié à l’agent utilisé pour l’immortalisation ainsi qu’à la possibilité d’une éventuelle production de cet agent (s’il est biologique) par les cellules. www.sg.cnrs.fr/cnps/guides/doc/risquebio/fiche2.pdf Fiches téléchargeables sur : (sécurité bio) http://www.sg.cnrs.fr/ 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Fiche 2 (origine INSERM) Les cultures cellulaires : Critères d’évaluation des risques Les milieux de culture : • facteurs de croissance, • facteurs d’attachement, • autres additifs : vitamines, ions, hormones, protéines de transport, sérum d’origine humaine ou animale, sang, liquide amniotique… • agents promoteurs de tumeurs, • antibiotiques, antifongiques, • produits génotoxiques : thioguanine, aminoptérine. La production par les cellules de : protéines, virus, parasites, bactéries. La probabilité de pénétration, d’intégration et de division de cellules en culture suite à un accident est un risque difficile à évaluer. Pour cette raison, les cellules d’origine humaine, mais également simienne, devront toujours être traitées comme un échantillon biologique à risque. Ne pas négliger non plus un éventuel risque chimique. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

6. CONDITIONS MATÉRIELLES DE LA CULTURE 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

6.1. La stérilité 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Filtre HEPA La stérilité est fondée sur la stérilisation de l’air par filtration qui utilise des filtres dits absolus arrêtant toutes les particules, filtres HEPA (High Efficiency Particulate Air Filter) classés comme suit : L’appareil utilisé est le PSM (poste de sécurité en microbiologie) -> 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Le PSM = poste de sécurité en microbiologie Il existe différents types de PSM. Celui présenté, minimum en biologie médicale, est de type II. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Le P4 Paru dans Science et vie JUNIOR en … Dossier réalisé par Betty MAMANE et Philipe PLAILLY (photos) Au CDC D’Atlanta 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

6.2. Les matériels particuliers 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Boîtes de culture 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Microscope inversé 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Dispositifs de prélèvements 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Filtration stérilisante 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Étuve aérobie à CO2 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

6.3. Les milieux de culture 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

TP : voici les composants à mélanger pour préparer le milieu de repiquage des cellules en TP : 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Constituants du milieu : d'eau d'ions minéraux nombreux et variés à des concentrations adéquates. L'osmolarité du milieu doit être celle du sérum physiologique (9 g par L de NaCl). Le pH ne doit le plus souvent guère varier autour de 7 à 7,4. de source de carbone et d'énergie (glucose par exemple) de source d'azote : acides aminés obligatoirement de facteurs de croissance métaboliques : ◦ les acides aminés essentiels ◦ les vitamines ◦ des acides gras comme l'acide arachidonique des gaz : ◦ le dioxygène les cellules étant aérobies strictes (p = 20 kPa) ◦ le dioxyde de carbone en général car les tissus sont en permanence dans une atmosphère contenant du dioxyde de carbone (p = 5,3 kPa) d'un pH maintenu constant vers 7,4 : Il faut donc un système tampon qui est en général le système CO2/HCO3- ou phosphates. 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Constituants du milieu (suite) : • des facteurs de croissance cellulaires : hormones et interleukines. Il s'agit souvent de mitogènes. Ils sont apportés de façon empirique par le le sérum de veau foetal 1,5 à 10 % (SVF=FCS) décomplémenté. Ces facteurs de croissance sont notamment ◦ l'EGF (facteur de croissance épidermique), ◦ le FGF (facteur de croissance fibroblastique) ◦ le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), ◦ IL2 (facteur de croissance des cellules T... Le sérum de veau foetal apporte aussi : de l'insuline et de la fibrinolectine qui permet l'ancrage des cellules aux parois du flacon. L'obtention du sérum de veau foetal n'est pas évidente : il faut pouvoir prélever stérilement des foetus, donc dans un premier temps abattre les vaches gravides. Cette production est souvent liée à l'élevage extensif où l'abattage du troupeau n'est pas sélectif et inclue donc de nombreuses vaches susceptibles de porter le veau. Le coût du SVF est donc très élevé (de l'ordre de 1000 euros le litre). Il peut poser problème de transmission de prions. Il ne faut toutefois pas exagérer le risque car les lieux de récolte sont des pays exempts comme l'Argentine et/ou l'Australie. • d'antibiotiques pour éviter la croissance de contaminants bactériens ou fongiques : ◦ pénicilline G ◦ streptomycine ◦ Amphotéricine B (antifongique) 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Constituants du milieu (suite) : • de la glutamine car bien qu'il y en ait dans les milieux elle se désamine spontanément à 37°C. Elle est rajoutée pour en avoir 1 %. • un indicateur de pH afin de contrôler visuellement le pH : au départ il doit être légèrement orange-rouge s’il devient plus franchement rouge, une alcalinisation anormale se produit. s’il devient franchement jaune, l'acidification signe probablement l’arrivée des bactéries… 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

7. QUELQUES RÉSULTATS 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Cellules MRC5 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Cellules 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

ECP MRC5 sans CMV 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

ECP MRC5 et CMV 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

ECP KB sans entérovirus 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

ECP KB et Entérovirus 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Caryotypage périnatal 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

Caryotypage cancer Cancer expérimental du poumon chez le rat 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

TP : Principe de l’entretien des cellules L’entretien des cellules consiste à les repiquer, c'est-à-dire à les séparer de leur ancien milieu de culture et à les réintroduire dans du milieu neuf. 1ère étape : Retirer le milieu de culture (vider dans le pot désinfectant) 2ème étape : Lavage à l’eau physiologique ou au PBS (2 lavages) 3ème étape : Trypsination. Verser 0,5 à 1 mL de la solution de trypsine. Laisser 1-2 minutes à 37°C ou 4-5 minutes à température ambiante. On peut suivre la dissociation sous microscope. Décoller les cellules en ‘’tapotant’’. (D’autres façons de faire sont possibles). 4ème étape : Remise en suspension. Une fois les cellules décollées, rajouter le milieu de culture (10 mL). La trypsine est neutralisée par le SVF présent. Mélanger (par aspiration-réaspiration). 5ème étape : Numération (cellule de Malassez) et remise en culture (à une densité correcte, possible dilution au 1/5ème pour les cellules MRC-5). Pour le TP : à partir d’une boite : 2 x 8 mL pour 2 boites, possible jusqu’à 5 x 8 mL…(Voir moins : environ 106 cellules par mL) 22 février 2006 Culture cellulaire 2006

au travail ! 22 février 2006 Culture cellulaire 2006