Sous la tutelle de Laurence Casalot Diagnostic Moléculaire Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs Sous la tutelle de Laurence Casalot Diagnostic Moléculaire Audrey BLANCHARD Nadège FOISELLE Le 25 novembre 2008

PCR-DGGE Technique permettant l’analyse de la diversité bactérienne d’un échantillon après amplification d’un gène donné Electrophorèse en gel dénaturant, contenant des concentrations variables de dénaturant, formant un gradient de dénaturation

PCR-DGGE Fragments d’ADN double brin plus ou moins dénaturés en fonction de sa séquence : GC% Enchaînement des acides nucléiques Ajout d’un îlot GC contenant une succession de G et de C sur 40pb Ilôt GC Ilôt GC Ilôt GC 0% dénaturation 30% dénaturation 70% dénaturation

PCR-DGGE Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE

PCR-DGGE Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE Electrophorèse non dénaturante DGGE 30% Gradient dénaturant 70%

PCR-DGGE Avantages Inconvénients Théoriquement, une bande par microorganisme présent dans l’échantillon Détection de mutation ponctuelle Séquençage possible des fragments Inconvénients Fragments de faible taille Parfois difficilement interprétable Temps de migration long

Anciennes techniques d’analyse de la diversité des SRP PCR-DGGE à partir du gène codant pour l’ARNr 16S PCR-DGGE à partir du gène dsrB

Limites de la PCR-DGGE sur ARNr 16S Absence d’amplification pour certaines espèces car les amorces utilisées ne sont pas spécifiques de toutes les espèces bactériennes de SRP Résultats obtenus non représentatifs de la réelle diversité des SRP dans les prélèvements Nécessité d’étudier un autre gène plus spécifique des SRP

Gène dsrB Le gène dsrB code pour la sous unité B de la sulfite réductase (dissimilatory (bi)sulfite reductase) Enzyme clé qui permet la libération d’énergie pendant la réduction des sulfates Enzyme uniquement présente chez les SRP Séquence du gène très conservée à travers les différentes espèces Topologie proche pour les arbres phylogénétiques construits à partir du gène dsrAB et du gène codant pour l’ARNr16S

Limites de la PCR-DGGE sur dsrB Migration de différents fragments à une même distance Nécessité de cloner les fragments d’ADN extrait des différentes bandes du gel avant de pouvoir les séquencer Long et fastidieux lorsqu’un grand nombre d’échantillons est concerné

Limites de la PCR-DGGE sur dsrB Migration de différents fragments à une même distance Absence d’amplification pour certains SRP Souches naturellement peu abondantes Mauvaise hybridation de l’amorce sens : jusqu’à 3 nucléotides différents Diminution de la sensibilité due à la présence de l’îlot GC sur l’amorce sens lors de la PCR

Amélioration de la PCR-DGGE sur dsrB But de l’équipe de Miletto : Mettre au point une technique permettant l’identification de l’ensemble des SRP d’un échantillon Amplification du gène dsrB de l’ensemble des SRP présent dans l’échantillon Séparation totale de l’ensemble des différents fragments d’ADN afin de réaliser un séquençage direct

Sélection des amplicons de 1,9kb Démarche Echantillon de sol Extraction de l’ADN ADN environnemental Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisens PCR dsrAB Nested PCR - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens Sélection des amplicons de 1,9kb Référence Clonage PCR dsrB Banque de clones dsrAB Amplicons dsrB - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens PCR dsrB Séquences dsrB Amplicons dsrB Séquençage

Nested PCR Principe Amplification par PCR avec un premier couple d’amorces Amplification par PCR avec un second couple d’amorces

Sélection des amplicons de 1,9kb Démarche PCR dsrB Amplicons dsrB Echantillon de sol Extraction de l’ADN ADN environnemental PCR dsrAB Sélection des amplicons de 1,9kb Clonage - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens PCR dsrB Banque de clones dsrAB Amplicons dsrB PCR dsrB DGGE PCR dsrB Séquences dsrB Amplicons dsrB Séquençage Séquences dsrB Séquençage

Résultats PCR-DGGE sur dsrB Approche directe Nested PCR Banque de clones (référence)

Résultats PCR-DGGE sur dsrB Résultats obtenus en nested PCR ne semblent pas présenter d’artefact dû à l’approche utilisée Augmentation du nombre de bandes détectables avec les stratégies de nested PCR et de clonage (90% de bandes communes) Diminution du biais introduit par la PCR : détection des souches peu abondantes Meilleure sensibilité Approche directe Nested PCR Banque de clones (référence)

Conditions de migration PCR-DGGE La qualité des résultats obtenus en PCR-DGGE ne dépend pas uniquement de la stratégie d’amplification Temps de migration élevé Voltage adapté Gradient de dénaturant adapté Migration 30h à 75V Gradient de dénaturant compris entre 35 et 80%

Analyse phylogénétique de dsrB Construction de l’arbre phylogénétique 97 séquences protéiques de dsrAB extraites de GenBank Méthode des distances Ajout manuel des séquences protéiques partielles déduites de dsrB méthode de parcimonie Mise en évidence d’une grande diversité des SRP dans l’échantillon Confirme les résultats obtenus en DGGE

Analyse phylogénétique de dsrB Abondance relative des différentes familles de SRP Famille Abondance relative (%) Clones DGGE Desulbobacteraceae 53 59 Desulfovibrionales Desulfomonile tiedjei gr. 8 7 Desulfobacterium anilini gr. 6 Firmicutes xénologues Desulfobulbaceae 24 Syntrophobacteraceae 3 Desulfobacca acetoxidans 11 Firmicutes orthologues Autes  Résultats comparables d’une technique d’étude à l’autre

Analyse phylogénétique de dsrB Abondance relative des différentes familles de SRP Famille Abondance relative (%) Clones DGGE Desulbobacteraceae 53 59 Desulfovibrionales Desulfomonile tiedjei gr. 8 7 Desulfobacterium anilini gr. 6 Firmicutes xénologues Desulfobulbaceae 24 Syntrophobacteraceae 3 Desulfobacca acetoxidans 11 Firmicutes orthologues Autes  Souches peu abondantes dans l’échantillon traité

Validation de cette technique Etude des variations de compositions de microcosmes Echantillon de vase prélevé en zone intertidale en Belgique Traité avec un régime de marée Utilisation d’une eau a une salinité différente Traitement de 4 semaines

Validation de cette technique Résultats Mise en évidence de l’enrichissement sélectif en SRP de l’espèce Desulfosarcina Confirme le résultat obtenu par une autre technique

Sélection des amplicons de 1,9kb Démarche Echantillon de sol Extraction de l’ADN ADN environnemental Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisens PCR dsrAB Nested PCR - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens Sélection des amplicons de 1,9kb Référence Clonage - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens PCR dsrB Banque de clones dsrAB Amplicons dsrB - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens PCR dsrB DGGE PCR dsrB Séquences dsrB1 Amplicons dsrB Séquençage Séquences dsrB2 Séquençage