Intégration de données génomiques: Transcriptome et ChIP-chip pour modéliser des réseaux de régulation Mahatsangy Raharijaona L’Institut du Thorax INSERM U915

Co-expression = fonction (Eisen et al., PNAS 1998) Echantillons Cluster Fonction Gènes Fonction et mécanismes de régulation spécifiques aux échantillons Régulation A B C F E D

Co-expression et Co-régulation PBX1 GATA3 ESR1 XBP1 CRABP2 PBX1 … Breast Carcinoma cell-lines Breast Carcinoma tumours Cancer du sein Bertucci et al. (2002) Hum. Mol. Genet. 11: 863-872. Quel est le réseau de régulation sous-jacent au cluster ? ? Survie GATA3 ESR1 CRABP2 XBP1 Tamoxifène

Etude des interactions protéines-ADN GATA3 => ESR1 Sur-expression ou K-O de FT Mesures des effets Gata3 over-expression ESR1 Indirect, non physiologique Gata3 knock-out ESR1 GATA3-dependent ESR1 expression MOTIFS dans leur promoteur ? Recherche du motif putatif Motif GATA3 dans le promoteur ESR1 Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) direct, physiologique GATA3 se fixe sur le promoteur ESR1

Etude interactions protéines-ADN ChIP Cross-link In vivo: cellules / tissus Coupure de l’ADN ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation Immunoprécipitation ChIP

(Orlando and Paro, Cell 1993) Analyse du ChIP ChIP Amplification Marquage Clonage, séquençage PCR (Orlando and Paro, Cell 1993) Hybridation sur puce de régions régulatrices: chip (Ren, Science 2000; Iyer, nature 2001…) Méthodes dérivées du SAGE: ChIP-PET (Wei, Cell 2006) ChIP-Seq (Robertson, Nat meth 2007) ? MON GENE

ChIP-chip Immunoprecipitation - Efficacité de l’anticorps http://www.chiponchip.org: 160 Anticorps validés en ChIP - Utilisation d’Ac a épitope c-Myc fusionné à la protéine d’intérêt (Lee, science 2002) - Production d’Ac Différents types de puces Taille région intergénique chez l’homme: 2Gb (3Gb taille génome). les îlots CpG « CpG Islands Array » (Weinmann, Genes Dev 2002) « Promoter Array » (Odom, Science 2004) Tiling array chromosome/génome (Bertone, Science 2004)

ChIP-chip (fluorescence)

DamID Cellules Eucaryotes (pas de A méthylés) Référence Dam seul Fusion FT-Dam Cellules Eucaryotes (pas de A méthylés) Expression in vivo du FT étudié, fusionné avec la DNA Adenine Methyltransferase d’E.coli Méthylation des A de GATC au voisinage du site de fixation du FT Isolement de l’ADN génomique Digestion enzymatique au niveau des Ame (GAmeTC) Séparation des brins digérés des brins génomiques (size-fractionation) Marquage cy5 Marquage cy3 Marquage et hybridation sur puce de régions régulatrices Taverner (Genome Biology, 2004)

Quel est le motif reconnu par le facteur de transcription ? Découverte de motifs Site de fixation du facteur de transcription = Motif reconnu sur l’ADN Quel est le motif reconnu par le facteur de transcription ? Le motif devrait être présent dans toutes les séquences positives, « absents » dans les négatives Existe-t-il d’autres motifs co-localisés avec ce motif ? => Identification de co-facteurs éventuels analyse en ChIP-chip

Découverte et recherche de motifs Exemple: ChIP-chip Ets 1/2 sur des lymphocytes T. Mesure de la fréquence de tous les oligonucléotides dans Ets+ et Ets-

Construction d’un réseau (données de Caroll, nat gen 2006) Signalisation et cytosquelette Métabolisme Voie Wnt

Modélisation de réseaux de régulation Intégration des données de génomique pour modéliser des réseaux de régulation transcriptionnelle B Différenciation H Apoptose C M I Prolifération A D G J L N E K O + F - Expression: Transcriptome Régulation: ChIP-chip Fonction: Bioinformatique Cible Thérapeutique : Modélisation Identification de cibles thérapeutiques