Les vecteurs Rétroviraux Jean-Christophe Pagès

Les rétrovirus Mammalian C-type Lentivirus Spumavirus Avian C-type BLV/ HTLV D-type B-type Premiers vecteurs

Famille : Retroviridæ Genres : Oncorétrovirus Lentivirus... LTR GAG POL ENV LTR 8 kb

Intérêts des rétrovirus comme vecteurs 1. Simplicité 2. Capacité de clonage de 11kb 3. Intégration du gène thérapeutique 4. Expression prolongée 5. Transduction de cellules in vivo 6. Transduction de cellules cyclant peu où différenciées.

Contraintes Structure du vecteur & Production…. Évolutions Spécificités du gène thérapeutique Prodrogue Facteur de croissance Replacement métabolique Modificateurs de survie Spécificités du patient et de la pathologie Pathologie en phase terminale Pathologie chronique Adultes Enfants

Aspects législatifs et éthiques CGG: donne un classement de l’OGM CGB: définit les conditions de sortie des patients Agence du médicament (AFSSAPS): Groupe de travail sur la thérapie génique Examen des demandes de protocoles cliniques Donne l’autorisation de l’essai. Seule la thérapie génique somatique est autorisée

DÉFINITIONS Transduction: Transfert viral Tropisme viral: Spécificité de reconnaissance de la cellule cible Déterminant: enveloppe virale Amphotrope Ecotrope Xenotrope Interférence: Impossibilité d ’infecter une cellule exprimant une Protéine d ’enveloppe virale avec un virus exprimant la même enveloppe Pseudotypage: Utilisation d ’une enveloppe hétérologue

Cycle des rétrovirus K Kß Expression virale Gène thérapeutique

Expression des gènes viraux LTR LTR MA p12 CA NC PRO RT IN Env Unité transcriptionnelle indépendante: Non Readthrough ou décalage sur knot SD SA Oui

Lignée Productrice GAG POL ENV Structure du vecteur???

R U5 PBS U3 R R U5 PBS U3 R U3 R U5 PBS U3 R U5 ppt U3 R U5 PBS ppt TATAA pA U3 R U5 PBS ppt U3 R U5

Structure du vecteur: éléments CIS Éléments pour la RT Éléments pour l’encapsidation Promoteur  PBS ppt Transgène

Cellule Productrice Cellule Transduite  LTR 5' LTR 3' LTR 5' LTR 3' AAA  LTR 5' LTR 3' Cellule Transduite LTR 5' LTR 3' AAA

Vecteurs particuliers Double copie Y PBS ppt Y PBS ppt Vecteurs « propres » LoxP Y PBS ppt Cre Y PBS ppt LoxP Cre LoxP

Les formes moléculaires des complexes de préintégration: Cercles ouverts Cercles fermés: 1 LTR ou 2 LTR

Sites d’intégration des rétrovirus

Éléments critiques Tropisme: Lié à l ’enveloppe (pseudotypage) Titre viral: Dépendant de la cellule productrice Résistance aux facteurs sériques pour l’in vivo: Liée à l ’enveloppe Dépendante de la cellule Sureté du vecteur: cf fin

Ciblage de la cellule à transduire Enveloppe rétrovirale VRA VRB PRR

Composés bispécifiques Enveloppes recombinantes

Ciblage par expression Vecteur d ’expression hépatospécifique: promoteur de la pyruvate kinase LTR L-PKp LDL-R LTR  -3200 -2080 -392 +11 Séquences activatrices Promoteur et éléments de réponse à l'insuline et à l'AMPc

A B LDL-R L-PK endogène GAPDH Régulation du promoteur de la L-PK dans les hépatocytes murins transduits: B Mise en évidence du LDL-R humain après transduction d’hépatocytes murins: Insuline 10-8 M + - Glucose 20 mM Glucagon 10-6 M LDL-R L-PK endogène GAPDH

Contrôle de l’expression par un système inductible TetO2 LTR CMVp Gène thérapeutique CMVp TetR

Limites des vecteurs rétroviraux: Cycle cellulaire Utilisation clinique: In vivo: Non Ex vivo: Cellules hématopoïétiques cf l’essai X-Scid

Cellules humaines myogeniques Transduction de CHQ5b: Cellules humaines myogeniques HIV MLV Myoblastes Myotubes

RT MLV HIV NLS PIC NLS PIC MA +/- +/- +/- Ka Kß CA +/- + HIV MLV NC + ? + RT + ? + INT ? + + + AccP + + CellF + +

Les vecteurs lentiviraux Famille : Retroviridæ Genre : Lentivirus Sous-espèces: -HIV 1 -HIV 2 -SIV -FIV -BIV -VISNA -CAEV -EIAV

GAG ENV POL U3 R U5 Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS Gag: MA CA NC p6 Vif Vpr Nef GAG Vpu ENV U3 R U5 POL TAT REV Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS Gag: MA CA NC p6 Vif : Dans les cellules non permissives: role dans la maturation des particules Pol: PR RT IN Vpr : Import nucléaire Arret en G2 Transactivation Env: SU TM TAT: Fixe TAR et favorise la processivité de la RNA pol II Vpu: Degradation de CD4 et MHC I Relargage des particules REV: Se fixe sur le RRE - Export des ARN non épissés - Export du messager GAG Nef: Down regulation de CD4 et MHCI

GAG POL ENV GAG POL DENV GAG POL ENV GAG POL DENV GAG POL U3 R U5 TAT REV Vif Vpr Vpu Nef Vif GAG POL DENV TAT REV Vpr Vpu Nef CMV InspA Vif GAG POL ENV TAT REV Vpr Vpu Nef CMV InspA GAG POL DENV TAT REV CMV InspA GAG POL CMV InspA RRE

Autres vecteurs lentiviraux EIAV: Non-Primate, 3 genes accessoires tat LTR tat rev rev gag LTR env pol S2 RT RH DU IN SD TAR Y cPPT RRE Pun HIV: Primate, 6 genes accessoires vpr LTR gag pol vpu nef LTR env RT RH IN TAR SD vif tat rev Y cPPT RRE Pun

Evolution des provirus recombinants Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS RRE Y PBS ppt RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant WPRE RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant pptc

Tropisme des vecteurs lentiviraux Naturel: Thérapie anti-VIH Pseudotypage: Enveloppe Amphotrope Enveloppe VSV-G

Production des vecteurs lentiviraux: 17K 21K Ultracentrifugation a/Titration p24 b/Titration sur cellules (4,5 103 pfu/ng p24) J0 293T p8.91+pHR’+pMD-G J1 Changement de milieu J2-J4 Récolte

Lignées productrices stables Toxicité de Rev: Solution 1: Rev inductible Solution 2: Gag-Pol Rev indépendants Mutagenèse des séquences par wobbling Toxicité de la VSV-G: Promoteur inductible: Tet VSV-G TetO2 CMVp pA TetR

Lentivirus et usage des codons MH WT CO Ala A 13 46 8 Cys C 68 10 70 Leu 3 14 Ser 34 35 55 GC 53 19 65 TG T 32 90 30 CT 26 17 AG G 11 58 TC 5 38 24 Gln 12 21 6 28 CA 88 47 79 TT 2 42 9 7 Arg 18 29 Glu 25 CG GA 75 62 Lys Thr 45 16 37 61 AA 82 72 AC 57 52 Gly 15 GG 50 Phe 80 20 Asn 78 71 Tyr 74 22 Pro TA His CC 48 39 Asp 64 Val 56 4 36 GT Ile 76 AT 92 77 23

Gag-Pol Optimisé pour les Codons pEV53B Rev Rev pA SD Gag Pol CMVp S2 * (Y) cPPT RRE pESYNGP CMVp pA Gag Pol Changement de codons de gag-pol à lexception du critique “frame-shifting” Délétion des homologies de sequence Rev-independant

Applications

Transduction de cellules hématopoïetiques Le virus possède un tropisme naturel pour ces cellules Les virus murins nécessitent une activation des cellules souches incompatible avec une prise de greffe sur le long terme.

Vecteurs EIAV : Expression in Vivo Rat thalamus 8 jours 24 semaines L’expression prolongée prévient la nécessité de ré-administrations

Le FIV vecteur de transfert de gènes

Limites des vecteurs lentiviraux Transduction de cellules arrétées ou de cellules activées: Cellules hématopoïétiques: Sutton et al. J. Virol. 1999 Unutmal et al. J. Exp. Med. 1999 Hépatocytes in vivo: Kay et al. Nat. Med. 2000 Conditions de production: Lignées stables: pas absolument nécessaire Deux essais cliniques en cours.

Développements

Cib Résultats actuels: In vitro OK En cellules : non Ciblage des intégrations: Cib Résultats actuels: In vitro OK En cellules : non

Organisation de l’ADN nucléaire Horn & Peterson Science 297:1824-27

Peu compacte: active Très compacte: inactive Influence de la structure sur l’expression Peu compacte: active Très compacte: inactive Horn & Peterson Science 297:1824-27

Les domaines de la chromatine La chromatine est organisée en domaines Chaque domaine est séparé d’un autre par des isolateurs Les domaines sont des boucles d’environ 50 kb Lors de la mitose les boucles sont contraintes par un complexe protéique

Structure d’un complexe isolateur Gaszner & Felsenfeld (2006) Nat Rev Genet 7:703-713

États fonctionnels de la chromatine Hétérochromatine : Réprimée, pas d’expression. Euchromatine: Inactive, mais potentiellement activable, ADN non transcrit. Active, transcription en cours

Utilisation des isolateurs ou « insulateurs »:

Autres causes d’extinction: Les modifications épigénétiques: De la chromatine. Profil de méthylation des histones: cellules ES H3K27me/H3K4me Différenciation H3K27me H3K4me Gène réprimé Gène exprimé

Méthylation des promoteurs La méthylation de l’ADN est un mécanisme de répression de l’expression. Les cytosines sont méthylées en position 5 dans les îlots CG: Nucleotide: Sequence: ...CG... ...C5mG...

Structure de la LTR de MLV U3 R U5 TATA Sites de méthylation Fixation de MeCP2 dans des cellules non permissives

Restriction par méthylation du promoteur

Vecteurs non intégratifs: Deux possibilités: Intégrase Les séquences att.

Sur CD34+

Analyse des jonctions de LTR: seuls les les wt/int+ sont classiques

BIO-SÉCURITÉ Lors de la production: Recombinaisons: Entre les séquences recombinantes Avec des séquences endogènes Mobilisation de virus endogènes Chez le patient: +/- Idem Pathologie de l ’intégration Modes de contrôles: Lignées cellulaires Utiliser un bon modèle animal

Les RCLs Développement de tests sensibles de détection des RCLs Le test doit considérer la structure des RCLs ????

Structures possibles des RCL Tout RCL doit exprimer Gag-Pol Le Gag-Pol doit provenir du vecteur R-U5 U3-R Env(v) gag-pol(e) gag-pol(v) Env(e) Rechercher l’activité RT (Pol). Rechercher des virus réplicatifs

Tests de RCL F-PERT assay comme première ligne Fluorescence-based Product Enhanced Reverse Transcriptase Assay PCR assay pour les résultats ambigus de PERT assay

Reverse transcription de MS2 RNA F-PERT: Product Enhanced Reverse Transcriptase Assay (MLV, AMV, HIV-1/2, EIAV, …) NP-40 Reverse transcription de MS2 RNA MS2 phage RNA RT primer Pol VLP MS2 cDNA ABI Prism 7700 (TaqMan) pol (10-100/virion) Independent de la nature générant les RCLs Haute sensitbilité (10-100 particles) Peu de faux positifs

Sensibilité du F-PERT Ct Activités RT MLV (Mn2+) et EIAV (Mg2+). 42 40 38 36 34 32 30 Ct 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 MLV neat MLV-1 MLV-2 MLV-3 MLV-4 MLV-5 EIAV neat EIAV-1 EIAV-2 EIAV-3 EIAV-4 EIAV-5 Media Media/DB water/DB water MS2cDNA MLV undisrupted EIAV undisrupted Activités RT MLV (Mn2+) et EIAV (Mg2+).

Réduire la genèse et l’impact de RCL Utiliser virus non pathogénique Séparer les éléments en au moins trois plasmides Cellule productrice stable élimination des séquences non codantes et codantes en cis Réduire la recombinaison homologue Réduire l’empaquetage non spécifique Test sensible des RCLs

LentiVecteur et Vecteur Retroviral Cross Transmission: LentiVecteur et Vecteur Retroviral 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 1.0E+07 1.0E+08 génome EIAV génome HIV génome MLV Titre (TU per ml) Gag-Pol EIAV HIV MLV EIAV et HIV moins de 1/1000 EIAV and MLV peu mobilisés par HIV NB: MLV est déjà utilisé pour les patients HIV

Vecteurs Self Inactivating (SIN) SIN LTR * CMVp LacZ Y mRNA Très faible expression de l’ARN génomique Les vecteurs SIN ne peuvent pas être introduits dans les lignées productrices par transduction.

EIAV LTR et SIN Vectors Y 8.1SIN 8.0 LTR 8Z20 CMV 5 8,742 11,133 Y copies par actine 5 8,742 11,133 35,116,825 SIN Control LTR CMV

Les « human SCID-X1 » Déficit: Récepteur des interleukines (2-4-7-9-15) Approche thérapeutique: Traitement ex vivo de la moelle osseuse Administration d ’un rétrovirus recombinant Réinjection

T Lymphocytes development after gene therapy of SCID-X1 9000 * P4 7000 > 3x106 CD34+ c +/kg 1x106 CD34+ c +/kg 5000 T Lymphocytes/µl * P10 P8 * P7 3000 P2 * P6. P5 1000 P9 P1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 months after gene therapy Patients living in a normal environment (4.4-8 years)

TRECs in SCID-X1 patients after gene therapy TREC/1x105 PBMC Levels of TRECs in PBMC 10000 P8 P7 P2 1000 P1 P10 100 P6 10 P4 P5 1 0,1 20 40 60 80 100 months post- gene therapy

SCID-X1 gene therapy trial: 4 proliférations tumorales Age (month) 1 3 8 11 Occurrence du SAE (month) 30 34 33 68 CD34+gc/kg 20 18 11.3 4.3 Clonal T cell proliferation  mature T  matureT Immature T Translocation 6:13 SIL-TAL,trisomy10 absent Sensitivity to treatment - + (+) Oncogène ciblé LMO2 BMI-1,LMO2,JUN-D CCND2

Sites d‘intégration P10 25.240 pb 49.499 pb 10.630 pb 9.319 pb BMI1 1 2 3 4 MFG c 5 6 7 8 9 10 11 2 SPAG6, chr10p12.31 25.240 pb 49.499 pb 2 MFG c 4 1 2 3 4 5 6 LMO2, chr11p13 10.630 pb Intergenic, chr19p13.11 JUND MFG c MFG c LSM4 9.319 pb

LMO-2 gene structure and integration of the provirus 1 2 3 4 5 6 MFG gc LMO-2 mRNA 2. 3 kb P5 P4 Enhancer activity P10 M. erythroleukemia LMO-2 RNA Transcript (Northern blot analysis) LMO-2 Protein expression (Western blot analysis) LMO-1 leukemia H. erythroleukemia P4 gd T CHO CHO/LMO-2 M-erythroleukemia LMO-2

Large-scale analysis of provirus integrations on SCID-X1 patients PBMCs *572 IS mapped to the human genome *62% in genes (+/- 10 kb) *Significant peak of insertion frequency was related closely to the TSS (28% within 5 kb surrounding the TSS)

Insertions in gene regions Transcription Start Site 18 % 16 % 14 % 12 % 10 % 8 % 6 % 4 % 2 % 0 % 50% to 100% 80% to 90% 70% to 80% 60% to 70% 50% to 60% 40% to 50% 30% to 40% 20% to 30% 10% to 20% 0% to 10% 5 kb -5 kb Insertion G in % 7 % 6 % 5 % 4 % 3 % 2 % 1 % 0 % Distance from transcription start site (kb) -1 to 0 -2 to-1 -3 to-2 -4 to-3 -5 to-4 -6 to-5 -7 to-6 -8 to-7 -9 to-8 -10t o-9 9 to 10 8 to 9 7 to 8 6 to 7 5 to 6 4 to 5 3 to 4 2 to 3 1 to 2 0 to 1 Transcription Start Site

Molecular functions of targeted genes Number Kinase activity 26 Membrane receptors-associated signaling proteins 11 Phosphotransferase activity DNA binding proteins 48 Transcription factors 22 Significantly different from integration by chance p < 0.016

Perspectives Intégration site spécifique Développement des formes non intégrées??? Labilité des particules Maîtrise de l’expression: promoteur, insulateurs. Administration in vivo: SNC: oui IV ???????