La chromatographie analytique : Phénomènes physico-chimiques liés à la séparation chromatographique. A. Van Camp

Plan Général Les forces intermoléculaires Solvants usuels en LC Phases stationnaires usuelles en GC Les phases stationnaires polaires en LC Les phases stationnaires inverses en LC L'échange d'ions La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

Les forces intermoléculaires en jeu Les partenaires de la séparation Phase stationnaire = PS (parfois appelée support) Phase mobile = éluant = PM GC : gaz LC : liquide Les constituants du mélange à séparer = m1, m2, ...

Les forces intermoléculaires en jeu > 0 < 0

Les forces intermoléculaires en CL Equilibre chromatographique : En chromatographie liquide : Force intermoléculaire Force intermoléculaire

Les forces intermoléculaires en GC Seule force intermoléculaire en jeu PM = N2, He, H2

Forces de dispersion de London : Les forces intermoléculaires Forces de dispersion de London : Molécules apolaires d+ d- d+ d- attraction entre dipôles instantanés interaction présente dans tous les composés n'intervient qu'à très courte distance importance augmente avec la polarisabilité du nuage électronique

Les forces intermoléculaires en jeu Forces de Keesom : attraction entre dipôles permanents d- d+ d- d+ d- d+ Molécules polaires d+ d-

Les forces intermoléculaires en jeu Forces de Keesom : attraction entre dipôles permanents n'intervient qu'à très courte distance Forces de Debye : attraction entre dipôle instantané et dipôle permanent

Les forces intermoléculaires en jeu X et Y = F, O ou N donneur Pont Hydrogène : attraction de type Keesom entre un H lié à un atome électronégatif et un autre atome électronégatif. interaction possible à plus longue distance accepteur

Les forces intermoléculaires en jeu Molécules apolaires : toutes les liaisons unissent des atomes d'électronégativités similaires (C et H) pas de dipôle permanent seule force intermoléculaire : London

Les forces intermoléculaires en jeu Molécules apolaires : il existe des atomes d’électronégativité différentes, mais il n’y a pas de dipôle permanent à cause de l’arrangement symétrique. exemple : le CCl4 d- d+ d- d- d-

Les forces intermoléculaires en jeu Molécules polaires : contiennent des liaisons entre atomes d'électronégativités assez différentes (C-O, C-N, O-H, N-H, …) présence de dipôle permanent forces de Keesom, Debye et London éventuellement : ponts H

Les forces intermoléculaires en jeu Attraction électrostatique entre ions de signe contraire Energie de « liaison » d’autant plus grande que le milieu est peu polaire (faible constante diélectrique) Se rencontre : Dans un cristal ionique Paires d’ions dans un solvant (séparées ou non par le solvant)

Les forces intermoléculaires en jeu Énergie de «liaison» Forces de dispersion de London Debye Keesom Pont Hydrogène Attraction entre ions de signes contraires

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Paramètre de polarité e0 Quelques solvants usuels en CL T° éb. Paramètre de polarité e0 Miscibilité à l’eau Fluoroalcanes -- - 0.25 non pentane 36.1° 0.00 toluène 110.6° 0.22 dichlorométhane 40° 0.42 acétate d’éthyle 77° 0.48 d+ d-

Quelques solvants usuels en CL oui 0.53 66° Tétrahydrofurane (THF) 0.60 82° isopropanol oui ! élevé 100° eau 0.7 64.5° méthanol 78° éthanol 0.52 81° acétonitrile 56° acétone Miscibilité à l’eau Paramètre de polarité e0 T° éb.

Quelques solvants usuels en CL Accepteurs et donneurs de pont H Accepteurs de pont H

Quelques solvants usuels en CL L'eau ! ! ! Forces de cohésion importantes : tension superficielle élevée eau : 73 mN/m méthanol : 23 mN/m viscosité élevée eau : 0,89 cP méthanol : 0,54 cP température d'ébullition exceptionnelle H2O (MM 18) : 100°C NH3 (MM 17) : - 33°C méthanol : 65°C constante diélectrique très élevée eau : 78 méthanol : 33

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Quelques phases stationnaires en GC Polarité croissante

Les forces intermoléculaires en GC PM = N2, He, H2 Elution rapide de molécules "volatiles" non pas à l'état pur, mais dans l'état adsorbé sur la PS utilisée. CH3OH sur diméthylsilicone (PS apolaire) se comporte comme une molécule "volatile". Son élution sur PS polyéthylèneglycol sera nettement plus lente. En revanche, à l'état pur les molécules de CH3OH s'associent par ponts H : le composé possède un point d'ébullition relativement élevé.

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Les phases stationnaires polaires en LC La silice : SiO2 Solide macromoléculaire Caractéristiques du solide : Forme des grains : sphérique ou irrégulière Granulométrie : 1,7 à 10 µm de diamètre moyen (ou plus pour la chromatographie préparative) Porosité : taille moyenne des pores ( 60 - 1000 Å); plus de 95% de la surface du solide se trouve dans le volume poreux. Pureté Groupes silanols en surface Donneurs et accepteurs de pont H Partiellement ionisés à partir d'un pH 3

Les phases stationnaires polaires en LC Échange sur la PS Interaction forte Interaction forte "Logique" d'élution : mode "normal" Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité croissante. Éluant puissant = éluant polaire, ayant une forte affinité pour la PS, tous les mi sont élués rapidement (non sélectif) Éluant sélectif = éluant apolaire (alcanes) Gradient = polarité croissante

Les phases stationnaires polaires Pentane 0,00 Hexane 0,01 Toluène 0,22 Dichlorométhane 0,30 Acétate d'éthyle 0,48 MTBE 0,48 Acétonitrile 0,52 Tetrahydrofurane 0,53 Méthanol 0,70 Échelle de polarité e° En pratique sur silice, un solvant polaire = dichlorométhane pur, acétate d'éthyle pur, un solvant contenant un faible %age d'alcool.

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Les phases stationnaires apolaires en LC Modification chimique de la surface de la silice : Phase inverse C18 Reversed Phase RP-C18

Autres phases stationnaires greffées Modification chimique de la surface de la silice : Autres "chimies" résultant de transformation des silanols de surface : R = -C8H17 (RP C8) -CH2CH2CH2-Phényl -CH2CH2CH2CN -CH2CH2OCH2CH(OH)CH2OH -CH2CH2CH2NH2 etc ... Phases polaires

Les phases stationnaires apolaires "Logique" d'élution : mode "inverse" Qui se ressemble, s'assemble ???

Les phases stationnaires apolaires Interaction forte Interaction forte "Logique" d'élution : mode "inverse" Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité décroissante. Éluant puissant = éluant non aqueux, solubilisant bien les composés mi. Ils sont tous élués rapidement (non sélectif). Éluant sélectif = éluant fortement aqueux, forte cohésion, où les composés mi sont faiblement solubles. Gradient = polarité décroissante, teneur en eau décroissante.

Les phases stationnaires polaires et apolaires : comparaison. Les plus polaires sont plus rapides Polarité décroissante Exemple : H2O + proportion croissante de CH3OH très polaire apolaire Phase inverse (RP) Les moins polaires sont plus rapides Polarité croissante Exemple : hexane + proportion croissante d’acétate d’éthyle peu polaire Phase normale (NP) Ordre d’élution Gradient d’élution PM PS

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L'échange d'ions Échange d'anions Échange de cations Séparation et dosage d'ions. Exemples : les nitrates dans l'eau une protéine dans un liquide physiologique Échange d'anions résine faible : DEAE (diéthylaminoéthyl), amino résine forte : ammonium quaternaire Échange de cations résine faible : -CH2COO- (CM, carboxyméthyl) résine forte : -SO3- (sulfonique) ex : SP = sulfopropyl

L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! Ka = 10-4, par exemple  pKa = 4 pH = pKa = 4 50% de HA, 50 % de A- pH = pKa - 1 = 3 90% de HA, 10% de A- pH = pKa - 2 = 2 99% de HA, 1% de A- pH = pKa + 1 = 5 10% de HA, 90% de A- pH = pKa + 2 = 6 1% de HA, 99% de A-

L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! Ka = 10-9, par exemple  pKa = 9 (càd : Kb = 10-5) pH = pKa = 9 50% de BH+, 50 % de B pH = pKa - 1 = 8 90% de BH+, 10 % de B pH = pKa - 2 = 7 99% de BH+, 1% de B pH = pKa + 1 = 10 10% de BH+, 90% de B pH = pKa + 2 = 11 1% de BH+, 99% de B

L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! résine résine

L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! CM, carboxyméthyl : résine résine SP, sulfopropyl : résine résine

L'échange d'ions R = résine K dépend surtout de la nature des ions échangés : affinité relative de Cl- et OH- / Na+ et H+ dans les exemples ci-dessus Deux facteurs : la charge de l’ion (ex : Mg++ plus retenu que Na+) pour une même charge, en phase aqueuse, c’est la taille de l’ion hydraté qui importe. F- et OH- (pour les anions), H+ et Li+ (pour les cations) ont des rayons hydratés très grands et sont peu retenus par la PS.

L'échange d'ions Sur résine forte adsorption élution Les concentrations agissent sur la position de l’équilibre. Une concentration élevée en ions, même de faible affinité, pourra éluer un ion fortement retenu. Gradient d’élution : concentration croissante en ions.

L'échange d'ions Sur résine faible adsorption élution Un tampon maintient le pH constant tout au long de la chromatographie. Il maintient une charge identique sur la résine. L'ion du tampon utilisé, ayant le signe contraire à la charge de la résine, est présent au moment du dépôt de l'échantillon (conditionnement). Gradient d’élution : concentration croissante en ions provenant d'un sel ne modifiant pas le pH (NaCl, par ex.)

Appariement d’ions sur phase inverse L'échange d'ions Appariement d’ions sur phase inverse La PS C18 est conditionnée avec un éluant contenant un surfactant anionique. Il se fixe sur la PS et elle se comporte en échangeuse de cation. Permet l’échange d’ions en phase organique. Echange d'anion avec un détergent cationique :

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Perméation de Gel - Exclusion stérique Séparation d'après la taille des molécules. Exemple de domaine d'application : biopolymères tels que les protéines polymères de synthèse La phase stationnaire est poreuse : le liquide qui s'y trouve occupe un volume Vp, qu'on appelle le volume poreux. La taille moyenne des pores est telle que certaines molécules n'ont pas accès à tout le volume poreux. molécules Un grain de PS

Perméation de Gel - Exclusion stérique Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0 Volume total du lit chromatographique : Vt Il est constitué de  90% de liquide : Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0 ( 30%) Volume poreux = Vp ( 60%) Un grain Vt  Vp + V0

Perméation de Gel - Exclusion stérique La concentration d’une molécule dans le volume poreux dépend des tailles respectives du pore et de la macromlolécule. Elle ne dépend pas d’interactions avec la PS ou la PM.

Perméation de Gel - Exclusion stérique Exclusion totale K = 0 Perméation totale K = 1

Pour une molécule de taille donnée : Perméation de Gel - Exclusion stérique Pour une molécule de taille donnée : VRi = V0 + Ki . Vp Fraction du volume poreux, accessible à la macromolécule i 0  K  1 Volume de rétention = volume de liquide sorti de la colonne jusqu'à l’élution de la macromolécule i volume interstitiel accessible à toute molécule quelque soit sa taille

Pour une molécule de taille donnée : Perméation de Gel - Exclusion stérique Pour une molécule de taille donnée : VRi = V0 + K . Vp Si on néglige le volume de solide dans le lit chromatographique : Vp = Vt - V0

Perméation de Gel - Exclusion stérique Pour des molécules de structure et de forme semblables, il existe une relation linéaire permettant d'établir des masses molaires (MM) moyennant un étalonnage avec des standards appropriés. Perméation sélective

Perméation de Gel - Exclusion stérique Deux phases stationnaires dont la taille moyenne des pores diffère.

En résumé En GC Eluant gazeux, interaction des constituants avec la PS En LC : PS polaires ou "normales": l'ordre d'élution des mi est l'ordre de polarité croissante, gradient d'élution de polarité croissante. PS apolaires ou "inverses": l'ordre d'élution des mi est l'ordre de polarité décroissante, gradient d'élution de polarité décroissante (diminution de la teneur en eau). Echange d'ion : élution par gradient de concentration ionique. Chromatographie d'exclusion stérique. Pas de différences d'interactions des mi avec la PM ou PS. Séparation d'après la taille. La plus utilisée !!!

Et ce n'est pas tout ... Chromatographie sur PS chirale Chromatographie d'affinité Chromatographie avec fluide supercritique Electrochromatographie etc ... Références générales très utiles : " Principes d'analyse instrumentale" Skoog, Holler, Nieman, De Boeck 2003. "Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, 2003.