Étude de la régulation épigénétique de l’allèle A br du gène Agouti chez la race bovine Normande. Fella Lamia HADJ-RABIA Ahmad OULMOUDEN (Dir. Thèse) Université des Sciences Génétique Moléculaire et Animale UMR 1061 INRA

Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994 ): « l’étude des changements dans l’expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou de la méiose, et qui ne résultent pas de modification de la séquence d’ADN » GénotypePhénotype Qu’est ce que l’épigénétique ? Comment des cellules ayant des gènes identiques peuvent-elles exprimer des groupes différents de ces gènes, selon les conditions environnementales, et acquérir ainsi des propriétés stables ? Holliday R. Epigenetics : an overview. Dev Genet 1994 ; 15 :

H2A H2B H3 H4 Structure dynamique de la chromatine et régulation épigénétique des fonctions du génome

b a heterochromatineeuchromatine b Structure et organisation de la chromatine, support de l’information épigénétique. Ac, acétylation ; Me, méthylation ; P, phosphorylation Ac Me P - Transcription - Réplication - Réparation

Méthylation de L’ADN La méthylation de l’ADN chez les mammifères ne s’effectue que sur des résidus Cytosine (C) précédant un résidu Guanine (G) Dinucléotide CpG DNMT = ADN méthyltransférase SAM = S-Adénosyl Méthionine (donneur de groupements méthyl)

Méthylation de l’ADN et l’état chromatinien

La répartition de la méthylation dans le génome

Génétique versus épigénétique ADN Chromatine Méthylation de l’ADN Ilots CpG Modification post-traductionnelle des histones F. Péronnet 2006

α α- MSH Mc1r Protéine G/ Adénylate cyclase Agouti AMPc + Tyr, Tyrp1, Dct Attractine Mahoganoïd α Eumélanine Pheomélanine Le « switch » de la mélanogenèse Poil Agouti

Le gène Agouti murin 1B1C1A1A’ Raly 23 4 ATGTGA 18 kb100 kb170 kb 127 pb111 pb 78 pb46 pb 170 pb 65 pb 385 pb Expression ventrale Cycle pilaire ∆Sur-expression ubiquitaire (A y ) IAP>> ARGESON et al. 1996; MICHAUD et al. 1994b. Expression ectopique variable (A vy ) Intracisternal A partical LTR

Le gène Agouti bovin

> > Structure et régulation du gène Agouti. Expression d’Agouti chez la Normande.

Expression dans différentes races 234 ATGTGA 3,4 kb 1,3 kb 170 pb 65 pb 354 pb Charolaise Limousine Salers Monbéliarde Normande Gascone Holstein H²O ADNc peau 3 transcrits aux extrémités 5’ et/ou 3’UTRs différentes Cerveau Rate Foie Poumons Reins H²ORT-PCR

Identification des régions régulatrices 1B3A1A2A 23 4 ATGTGA 169 pb498 pb162 pb170 pb 65 pb 354 pb 83 pb 1,7 kb A B C 414 nt 714 nt 153 nt 2 promoteurs alternatifs putatifs.

> > Structure et régulation du gène Agouti. Expression d’Agouti chez la Normande. >

Expression d’Agouti dans la peau - Génotype : E/E -Bringeure : rayures ou taches noires irrégulières sur un fond rouge clair à foncé. - Souris mosaïques : mutations d’Agouti (IAP) La Normande

Normande Salers Expression du gène Agouti dans la peau Northern blot RT-PCR ½ Quantitative GIRARDOT et coll., HolstNorSalLim

Tyrp1 Quantification chez la Normande - Corrélation inverse avec Tyrp1 - Corrélation avec le phénotype Agouti - Sur-expression HolstNor 614Nor 549Nor 138

Agouti dans différents tissus Foie Coeur Bringé Blanc Marron Poumon nt 600 nt - Transcrit spécifique de la peau : 600 nt - Transcrit surexprimé spécifique de la Normande : 800 nt

Transcrits alternatifs 1C 234 AUG UGA A (n) 1C 647 nt 2C 234 AUG UGA A (n) 2C 750 nt 1C 234 AUG UGA A (n) 2C G (6) 1C2C 814 nt 58 pb 161 pb 170 pb 65 pb 354 pb 393 pb 325 pb

Caractérisation de l’insertion c c d d LINE : Long Interspersed Element (8402 bp) A (n) TSD G (6) 2C GT ORF1 ORF2 309 aa1273 aa

23 4 ATGTGA 1B3A1A2A1C 2C - 3 promoteurs alternatifs - Régulation traductionnelle A & B - Isolement du premier LINE bovin complet - mutation gain de fonction (A br ) - Méthylation du LINE réprime l’expression de A br Structure de la région du gène Agouti chez la Normande

Objectif Étudier l’association entre les mécanismes épigénétique et la variégation de L’expression de l’allèle A br dans différents tissus chez la race Normande

Approches Ce travail est mené sur une trentaine d’animaux, dont l’ADN génomique a été extrait à partir des différents organes (foie, poumon, rein et coeur Le patron de méthylation de la région promotrice du LINE est établi par traitement au bisulfite suivi d’une PCR et séquençage de la région d’intérêt

me Traitement au bisulfite

%CpG meth total: 66/132 soit 50% Dans 5’: 17/24 soit 70% Dans Line: 49/108 soit 46% 12 clones %CpG meth total: 100/132 soit 75% Dans 5’: 23/24 soit 95% Dans Line: 77/108 soit 71% 12 clones Région 5’Promoteur LineRégion 5’Promoteur Line 1486: A/A br 9159 : A/A br méthylation de l’allèle A br au niveau du Poumon méthylation de l’allèle A br au niveau du Poumon Poumon/ADNg -Bisulfite -PCR -Clonage -Séquençage

%CpG méth dans LINE dans différents tissus Plus la robe de l’animal est foncée, plus le degré de méthylation est élevé

Conséquences de l’état de méthylation de A br

Pour conclure….. L’allèle Abr du gène Agouti est responsable du patron de coloration des animaux de la race Normande. La variégation du phénotype entre les animaux et au sein du même animal est corrélée à une méthylation différentielle du promoteur du LINE. Une corrélation au niveau transcriptionnelle en relation avec cette méthylation différentielle est en cours d’étude

Merci de votre attention