Du Phénotype au Génotype
Amplification de l’ADNc de la GFP
La Reverse Transcription Il s’agit de synthétiser le brin d’ADN complémentaire à partir d’une séquence amorce correspondante à la GFP. ARNm total + amorce + enzyme: reverse transcriptase + tampon Solution d’ADNc préparée par RT-PCR
PolyChain Reaction La PCR permet de fabriquer le second brin de l’ADNc par complémentarité. Cependant l’utilisation d’un double brin étant insuffisante, il faut donc le répliquer en grande quantité. Ce processus se déroule en 3 étapes: -La dénaturation de l’ADNc à 95° -L’hybridation à 54° -L’élongation à 72° Marqueur Contrôle (+) Contrôle (-) PCR (des 4 groupes)
Purification du produit PCR Le but de cette étape est de séparer l’ADN de sa solution. Il existe 2 techniques: La purification sur gel et le "gene clean" GFP après purification sur gel Marqueur
L’électrophorèse Résultats : On a obtenu une séquence d’ADN spécifique au caractère fluorescent sous rayons UV. Enzymes utilisés: -Hind III -Bam H1 Marqueur Plasmide non digéré Plasmide digéré GFP digéré Après Gene Clean
Plasmide GFP Plasmide Digestion Ligation
Marqueur Contrôle (+) Contrôle (-) GFP après purification sur gel Marqueur