TILLING :Targeting Induced Local Lesions IN Genomes Obstacle : Pas d’outil de génétique inverse à haut débit pour étudier la fonction des gènes et associer un phénotype à une séquence d’ADN Objectif : Développer un outil combinant une haute densité de points de mutation & un screening rapide des mutations pour découvrir des lésions induites Démarche: Constitution d’une collection de mutants EMS et recherche systématique de mutations dans des gènes cibles par détection des mésappariements lors de la formation des hétéroduplex Targeted screening for induced mutations McCallum et al Nat. Biotechnology 2000

Mutagénèse EMS Graine M1 Graine M0 plante M1 Autofécondation collection de mutants EMS Mutagénèse EMS EMS Graine M1 Graine M0 Autofécondation plante M1 Récolte des graines M2 Traitement et stockage des graines M2 à 4°C

1- Collection de mutants EMS Principe 1- Collection de mutants EMS 2- Collection d’ADN et pooling des familles M2 3- Gène candidat : amplification par PCR de la région d’intérêt 4- Détection des mutations Dénaturation et annealing : formation des hétéroduplex entre les fragments WT et mutants Clivage enzymatique (endonucleases) Electrophorèse sur séquenceur Li-Cor Identification des pools positifs Déconvolution des pools positifs et identification des familles M2 mutantes Séquençage des mutations 6- Confirmation du phénotype

Collection d’ADN des familles M2 Extraction des ADN 12 plantes M2/famille 2 disques foliaires par plante Soit 24 disques par puit ADN des familles M2 extrait et conservé à -80°C Vérification sur gel d’agarose et par PCR

Pooling des ADN des familles M2 Collection d’ADN Pooling des ADN des familles M2 ADN par famille ADN poolé 8 fois 768 familles par pool 7 superpools d’ADN dilué conservés à -80°C ~5000 familles M2

1- Collection de mutants EMS Principe 1- Collection de mutants EMS 2- Collection d’ADN et pooling des familles M2 3- Gène candidat : amplification par PCR de la région d’intérêt 4- Détection des mutations Dénaturation et annealing : formation des hétéroduplex entre les fragments WT et mutants Clivage enzymatique (endonucleases) Electrophorèse sur séquenceur Li-Cor Identification des pools positifs Déconvolution des pools positifs et identification des familles M2 mutantes Séquençage des mutations 6- Confirmation du phénotype

Recherche des régions les plus favorables dans le gène candidat The CODDLE (for codons optimized to discover deleterious lesions) program uses genome sequence data as input and determines which exons are most likely to yield nonsense and missense mutations, taking into account the mutagen that was used and the genome being studied. http://www.proweb.org/coddle/

1- Collection de mutants EMS Principe 1- Collection de mutants EMS 2- Collection d’ADN et pooling des familles M2 3- Gène candidat : amplification par PCR de la région d’intérêt 4- Détection des mutations Dénaturation et annealing : formation des hétéroduplex entre les fragments WT et mutants Clivage enzymatique (endonuclease) Electrophorèse sur séquenceur Li-Cor Identification des pools positifs Déconvolution des pools positifs et identification des familles M2 mutantes Séquençage des mutations 5- Confirmation du phénotype

Détection sur séquenceur LI-COR Détection des mutations Détection sur séquenceur LI-COR

Détection des mutations MT MT

Identification des pools positifs Détection des mutations Identification des pools positifs Gène cible : CRTISO3 Ct+ Ct+ Ct+ 661bp MT 598bp 405bp 256bp ADN poolé 8 fois soit 768 familles/run

Déconvolution : analyse de l’ADN de la famille individuelle Détection des mutations Déconvolution : analyse de l’ADN de la famille individuelle issue du pool positif SP12 SP93 SP12 SP93 SP12 SP93 Sans dilution Dil. 1/5 Dil. 1/10

Séquençage des mutations Détection des mutations Séquençage des mutations mutant sauvage Mutation G A Effet D (aspartate) N (asparagine) Disparition de la charge négative : peut entraîner une modification de la protéine

Principe de la technique 1- Collection de mutants EMS 2- Collection d’ADN et pooling des familles M2 3- Gène candidat : amplification par PCR de la région d’intérêt 4- Détection des mutations Dénaturation et annealing : formation des hétéroduplex entre les fragments WT et mutants Clivage enzymatique (endonucleases) Electrophorèse sur séquenceur Li-Cor Identification des pools positifs Déconvolution des pools positifs et identification des familles M2 mutantes Séquençage des mutations 5- Confirmation du phénotype

Phénotypage des mutants sélectionnés : séries alléliques Confirmation du phénotype Phénotypage des mutants sélectionnés : séries alléliques Famille M2 mutante Phéno - Phéno + M3 (1: 2 : 1) BC successifs avec WT autres mutants Série allélique x Tests d’allélisme 6 à 7 générations de BC F1 confirmation de la liaison phénotype/mutation Rq: Test phéno précis indispensable

TALEN, Transcription Activator- Like Effector Nuclease TALE: structure de base chez Xanthomonas TALEN: TALE + nucléase FokI

Des outils pour l’amélioration des plantes TILLING/TALEN Des outils pour l’amélioration des plantes A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING. Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, Steine MN, Facciotti D. Nature Biotechnology 2005 Jan;23(1):75-81. Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING Bradley J Till, Steven H Reynolds, Clifford Weil, Nathan Springer, Chris Burtner, Kim Young, Elisabeth Bowers, Christine A Codomo, Linda C Enns, Anthony R Odden1, Elizabeth A Greene, Luca Comai and Steven Henikoff BMC Plant Biology 2004, July 4(12): 1-8 High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice Ting Li , Bo Liu , Martin H Spalding, Donald P Weeks & Bing Yang. Nature Biotechnology 2012 May; 30(5): 390-392