Université de Liège Centre d’Ingénierie des Protéines Recherche de nouveaux métabolites secondaires chez les Streptomyces La Condromycine: Histoire d’un antibiotique mort-né … Matthias Craig

Introduction Streptomycètes Bactéries Gram + filamenteuses colonisant les sols

Introduction Streptomycètes Producteurs de 2/3 métabolites secondaires utilisés en médecine et dans l’industrie agroalimentaire

Introduction Streptomycètes Séquençage des génomes de S. coelicolor et S. avermitilis révèlent la présence de nombreux clusters « cryptiques ».

Introduction Les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques posent un grave problème médical.  recherche de nouvelles molécules. Le groupe Strepto a décidé de rejoindre l’ensemble du CIP dans cette cette aventure.

Quels sont les signaux environnementaux perçus déclenchant le passage du métabolisme primaire au métabolisme secondaire ?

Spectre de masse: 1079 Da et présence d’un atome de bore Criblage de la collection de Streptomyces du CIP pour la recherche de nouveaux antibiotiques Souche S. sp. G2 Streptomyces sp G2 produit un métabolite secondaire inhibant la croissance de bactéries Gram-positives (MRSA). Spectre de masse: 1079 Da et présence d’un atome de bore

- Produit par Sorangium cellulosum Il existe trois antibiotiques naturels caractérisés contenant un atome de bore * Le tartrolon: - Produit par Sorangium cellulosum Mw = 888 Da * L’aplasmomycine: Produite par Streptomyces griseus Mw = 799 Da * La boromycine: Produite par Streptomyces antibioticus Mw = 866 Da

Objectifs du doctorat Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G2. Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). Recherche de la cible de l’antibiotique. Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).

Résultats 1) Génotypage de Streptomyces sp G2 en amplifiant, clonant et séquencant le gène codant pour les RNA 16S et les Internally transcribed spacers (ITS).

Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine en milieu liquide. 16 h 22 h 40 h 46 h 112 h TSB + glycérol 1% MM + glycérol 1% MM + glucose 1% MM + chitine 1% MM + mannitol 1% MM + GlcNAc 1% TSB + glycérol 1% + chitine 0,5%

Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine sur milieu gélosé. MM + glycérol 1% MM + chitine 1% R2YE MM + MM + mannitol 1%

Mise au point d’un protocole de production et de purification de condromycine. La souche S. sp. G2 ne produit plus l’antibiotique en milieu liquide. Mutagenèse chimique au NTG Substitution: GC  AT

NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII témoin Screening des colonies après incubation des spores avec du NTG et caractérisation des mutants potentiels 15 mutants potentiellement surproducteurs 21 mutants potentiellement non producteurs 3 mutants présentant un phénotype fortement altéré Non producteur S. sp. G2 Surproducteur Mutant brun 9 mutants surproducteurs confirmés NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII témoin

4 cultures de 250 ml en TSB + glycérol 1% + chitine 1% Purification: Extraction liquide-liquide Purification trois pics sur colonne semipréparative.  35 mg pics A, B et C

Activité biologique Enterococcus faecium Enterococcus faecalis hirae ATCC 9790 Enterococcus hirae EHR Enterococcus hirae R40 Enterococcus hirae SRI Escherichia coli JM109

Propriétés physico-chimiques 5795,6 Spectres UV: Stabilité thermique et résistance aux protéases. Spectre de masse. Pronase 4 μg/mL 24 h 37°C 90°C 1h30 1282,1 597,4 1267,9 control traitement

Production et purification de la condromycine sur milieu gélosé. 100 boîtes de milieu R2YE (2,5 litres)  spores du mutant surproducteur SPXII. Condromycine extraite du milieu gélosé en présence d’acétate d’éthyle. Purification par HPLC (colonne C18) et séparation des trois pics.  150 mg

Spectre de masse des pics A, B et C

… Et c’est l’embardée … Pic A: 1254,7  Actinomycin D : 1255,4 Litt.: Spectre 1H de actinomycin D spectre 1H obtenu de fraction B Pic A: 1254,7  Actinomycin D : 1255,4 Pic B: 1268,8  Actinomycin C2 : 1269,4 Pic C: 1282,8  Actinomycin C3 : 1283,5 Condromycine = Actinomycine? Masses très proches Spectre d’absorption similaire Même activité (actif contre les gram +) Même spectre RMN du proton

CONDROMYCINE  ACTINOMYCINE

Objectifs Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G2. Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). Recherche de la cible de l’antibiotique. Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).  S. sp. G2 = Sous-espèce de S. griseus Masse, spectre UV, stabilité thermique, stabilité en fonction du pH, hydrophobicité, … Se lie à l’ADN empêchant la transcription en ARN  hautement toxique.

Recherche de nouveaux métabolites secondaires Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP.  Génotypage des souches non identifiées

Recherche de nouveaux métabolites secondaires Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. Méthodologie « dasR » Facteur de transcription pléiotropique. Métabolisme de la GlcNAc. Scan du génome de S. coelicolor pour identifier les sites dre (dasR-responsive element). ActII-4 et redZ.

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 M145 BAP29 ActII-4 redZ

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR ». DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 coelicheline

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 Gray spore pigment

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 Gènes SCO6273 à SCO6288 régulés par scbR et scbA en amont desquels on retrouve un site dre. scbR scbA

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 SCO6280 = KasO SCO6273

Recherche de nouveaux métabolites secondaires Et en pratique… 1 2 3 4 1 = M145 MM + mannitol 1% 2 = BAP29 MM + 3 = M145 MM + GlcNAc 1% 4 = BAP29 MM + MM MM + GlcNAc M145 ΔdasR

Recherche de nouveaux métabolites secondaires BAP29 MM + GlcNAc 1% Spot noir provenant de la TLC

Recherche de nouveaux métabolites secondaires 1 2 3 4 1 = M145 LB + glucose 1% 2 = BAP29 LB + glucose 1% 3 = M145 LB + chitine 1% 4 = BAP29 LB + chitine 1%

Recherche de nouveaux métabolites secondaires Jus de culture BAP29 LB + glucose 1% Pic 1 Pic 2 Spot fluorescent provenant de la TLC

Perspectives Effet de la GlcNAc sur d’autres Streptomycètes. Streptomyces clavuligerus 1 2 3 4 5 6 1 = MM + mannitol 1% 2 = MM + GlcNAc 1% 3= MM + glucose 1% 4 = MM + glucose 1% + GlcNAc 1% 5 = MM + chitine 1% 6 = MM + chitine 1% + GlcNAc 1%

Perspectives  Nouveau(x) métabolite(s) à caractériser… PCR pour identifier les souches de la collection possédant le gène dasR. Inactivation du gène  Réveil de métabolites cryptiques? Etudier le métabolome des souches de la collection sur différents milieux en présence de différentes sources de carbone et d’azote.  Nouveau(x) métabolite(s) à caractériser…

Merci pour votre attention … Sébastien Rigali et toute l’équipe strepto Bernard Joris Jérôme Paris