Optimisation des conditions d’actions de la protéinase K au cours d’une hybridation in situ sur embryon de lamproie

Plan général

PARTIE ECONOMIQUE Le CNRS : son histoire, sa hiérarchisation, ses ressources, ses dépenses L’IEM : ses structures, ses projets L’équipe « développement et évolution des vertébrés » : ses projets

PARTIE SCIENTIFIQUE Introduction L’hybridation in situ : une étape décisive Mise au point des conditions d’utilisation de la protéinase K Application du nouveau protocole

DISCUSSION Utilité de la mise au point Application à grande échelle Aide précieuse pour la continuité de la recherche sur les vertébrés

PARTIE ECONOMIQUE

Le Centre National de Recherche Scientifique 19 octobre 1939 : création 1945 : recherche fondamentale Années 80 : unités mixtes de recherche Large spectre de connaissance, implantation partout dans l’hexagone

Le CNRS en chiffre 18 délégations 1256 unités de recherche Plus de 4000 brevets déposés Création de plus de 100 entreprises depuis 1999 81 accords avec 50 pays

Les ressources du CNRS Subventions de l’Etat : 72% Ressources propres : 15% Amortissements : 9%

Les dépenses du CNRS Masse salariale : 48% Fonctionnement : 23% Amortissements : 9%

L’unité immunologie et embryologie moléculaire Reconnaissance moléculaire et immunité innée Immunité acquise et allergie Morphogenèse et embryologie moléculaire Développement et évolution des vertébrés

L’équipe « développement et évolution des vertébrés » Embryologie et histologie Génétique du développement : souris, lamproie Comparaison chez les autres vertébrés

PARTIE SCIENTIFIQUE

Introduction Lamproie : cyclostomes À la base de l’évolution des vertébrés

Pourquoi la lamproie ? Étudier la génétique du développement Définir les mécanismes moléculaires qui fondent ce groupe : les vertébrés Corrélations avec les autres vertébrés

L’hybridation in situ Peu connue chez la lamproie Nécessite une mise au point Utilisation à grande échelle

Matériel et méthode

Technique d’hybridation Synthèse de sondes ARN anti-sens Détection d’un brin d’ADNm sur l’embryon

Duplication de l’ADNc Intégration d’un ADNc dans le plasmide Amplifié par réaction de polymérisation en chaîne

Synthèse de matrice PCR Nécessaire en grande quantité pour la synthèse des sondes ARN Enzyme utilisée : Taq polymérase (72°C)

Principe de la PCR

Synthèse des sondes ARN Transcription in vitro de l’ADN en ARN Incorporation d’un nucléotide marqué à la digoxigénine

Hybridation sur embryons in toto Fixation des sondes ARN anti-sens synthétisées sur les ARNm cibles Fixation des anticorps anti-digoxigénine sur les sondes ARN Révélation chromogénique Visualisation des territoires d’expressions des sondes ARN

RESULTATS

Mise au point des conditions d’hybridation sur embryon de lamproie Test des conditions type « roussette » Mise au point des conditions d’action de la protéinase K Tests des conditions sur deux nouveaux gènes : Pitxa1, NeuroD

Tests des conditions « roussette » Photographie Résultats Conclusions Taches violettes Cassure sur la partie postérieure Débris de chorion Bruit de fond Cassure sur la partie antéro-dorsale

Conclusion du test Présence de bruit de fond : signaux spécifiques masqués Résultat insatisfaisant  Mise au point

Optimisation des conditions d’action de la protéinase K Problème de bruit de fond : réglé Incubation à différents temps Détermination du temps d’action optimal

7.5min à 37°C 15min à 37°C 22.5min à 37°C 30min à 37°C 45min à 37°C 45min à température ambiante

Conclusion de l’optimisation Apparition des signaux de manière progressive Bruit de fond éliminé Temps d’action optimal : 45min à 37°C

Test sur NeuroD Photographies Résultats - Observations Signal spécifique dans tout le système nerveux de l’embryon

Discussions Conditions d’hybridations sur l’embryon de lamproie Optimisation à petite échelle Application à grande échelle Mécanismes de la génétique du développement des vertébrés