Rappel: Équilibre acide-base Spectrophotométrie CHMI 2227F Biochimie I Rappel: Équilibre acide-base Spectrophotométrie CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équilibre acide-base - Acides forts HCl  H+ + Cl- pH = - log [H+] Où [H+] est en unités de concentration molaires (M). Les acides forts se dissocient complètement dans l’eau. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équilibre acide-base - Acides faibles Où: HA est l’acide non-dissocié. A- est la base conjuguée de l’acide HA. HA H+ + A- Ka = [H+] x [A-] [HA] pKa = -log Ka Ka = 1 10pKa Les acides faibles ne se dissocient pas complètement dans l’eau.; Le degré de dissociation de l’acide faible dépends de sa constante de dissociation (Ka). CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équilibre acide-base - Acides faibles Le pH se solutions d’acides faibles peut être déterminé en calculant d’abords la [H+], en tenant compte du Ka de l’acide; Ka = [H+] x [A-] [HA] pH = - log [H+] Alternativement, on peut aussi utiliser l’équation d’Henderson-Hasselbach: pH = pKa +log [A-] [HA] CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équilibre acide-base - Acides faibles HA H+ + A- L’ajout d’une base forte à une solution d’acide faible mènera à la conversion progressive de HA en A-. Notons que le pH de la solution ne change pas beaucoup près de la valeur du pKa: la solution est alors tamponnée. pH Point de mi-équivalence: 50% HA 50% A- 100% A- pKa pH au point de mi-équivalence = pKa 100% HA 0.5 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. NaOH

Équilibre acide-base - Acides faibles Exemple 1: Quel est le pH d’une solution de 0.1M d’acide acétique (Ka = 1.76 x 10-5M). CH3-COOH CH3-COO- + H+ Ka = 1.76 x 10-5 M = [H+] x [A-] = [H+]2 [HA] [HA] [H+]2 = 1.76 x 10-5 M x [HA] = 1.76 x 10-5 M x 0.1M [H+] = 1.33 x 10-3 M Finalement: pH = -log [H+] = 2.88 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équilibre acide-base - Acides faibles Exemple 2: Quel sera le pH d’une solution composée de 0.3 M d’acide acétique et de 0.1 M d’acétate (pKa = 4.8). CH3-COOH CH3-COO- + H+ pH = pKa + log [A-] [HA] pH = 4.8 + log 0.1M 0.3M pH = 4.8 + (-0.477) pH = 4.3 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie Cuvette Source lumineuse Détecteur Lumière Lumière L’intensité de la lumière transmise est égale à celle de la lumière incidente. Lumière incidente Lumière transmise L’intensité de la lumière transmise est inférieure à celle de la lumière incidente. Lumière incidente Lumière transmise En d’autres mots, la solution bleu a absorbé une partie de la lumière incidente. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie Différentes sources de lumière peuvent être utilisées. En biochimie, les deux principales sources lumineuses utilisées sont: Lumière visible (solutions colorées); Lumière ultraviolette ( composés incolores mais ayant des liaisons doubles conjuguées ou des noyaux aromatiques). Pour cette raison, on appelle cette méthode la spectrophotométrie UV-Vis. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie La longueur d’onde à utiliser dépends du type de composé auquel tu t’intéresses. Généralement, des expériences préliminaires sont effectuées afin de déterminer la longueur d’onde à laquelle la molécule d’intérêt absorbe davantage Augmente la sensibilité de la détection. Intensité d’absorbance Longueur d’onde (nm) 400 450 500 550 600 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie La puissance de la spectrophotométrie est qu’elle permet d’utiliser la quantité de lumière absorbée afin de mesurer quelque chose. On utilise l’absorbance au lieu de l’intensité de lumière transmise simplement parce qu’il est plus facile de voir des différences entre échantillons. Par exemple: Solution A: 1M: 65% transmission et 0.25 absorbance 2M: 70% transmission et 0.5 absorbance La relation entre l’intensité de lumière transmise et l’absorbance est donnée par l’équation de Beer-Lambert. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie - équation de Beer-Lambert Where: T = intensité de transmission A = absorbance l = trajet optique (épaisseur de la cuvette)(cm) c= concentration (M) e = coefficient d’absorption (M-1cm-1) -logT = log (1/T) = ecl =A Généralement, l = 1 cm. e est une propriété de la molécule d’intérêt, obtenu dans des conditions standards, et est retrouvée dans des manuels. Donc: si tu connais A, l et e, tu peux facilement déterminer c. Cependant, e n’est pas souvent connu, ou sa valeur n’est pas applicable sous les conditions prévalant dans le labo. Que faire, que faire, que faire?????????????? CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Courbe standard Partie non-linéaire de la courbe ATTENTION!!! Intensité d’absorbance Concentration(unités) 3 6 9 12 Absorbance de l’inconnu Concentration de l’inconnu Partie non-linéaire de la courbe ATTENTION!!! Très utilisées en biochimie Principe très simple: L’absorbance d’une série de solutions du composé d’intérêt, de concentration connue, et d’abord déterminée. Une graphique de l’absorbance en fonction de la concentration est alors préparé. CECI EST TA COURBE STANDARD. L’absorbance du même composé, mais de concentration inconnue, est alors déterminée. En autant que la valeur d’absorbance de l’inconnu est située dans la partie linéaire de la courbe standard, tu peux facilement déterminer la concentration de ton échantillon. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Spectrophotométrie La spectrophotométrie est utilisée tout le temps en biochimie, et pas seulement pour mesurer la concentration de molécules: Réactions enzymatiques: La formation/l’utilisation par une enzyme d’une molécule absorbant la lumière peut être déterminée en fonction du temps par spectrophotométrie. Ceci permet de suivre le progrès de réactions enzymatiques. Détection de substances: Les protéines absorbent à 280 nm; La spectro UV-Vis est souvent utilisée afin de suivre le progrès de la purification d’une protéine (mesure de l’absorbance à 280 nm). Pureté d’un échantillon: Les solutions pures d’ADN absorbent à 260 nm et 280 nm d’une telle manière que le rapport A260/A280 est d’environ 2. Un rapport A260/A280 inférieur à 2 nous indique que la solution d’ADN est probablement contaminée par des protéines. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.