L’ARN interférence Chantal Vaury GReD UMR/CNRS6247, Clermont Université, INSERM U931 Clermont-Ferrand

Introduction générale Le principe de conservation

Le principe de conservation Il existe chez tous les êtres vivants des mécanismes communs tels que la production d’énergie, la réplication de l’ADN ou le transport des molécules. Il est par conséquent possible d’étudier ces processus en utilisant des organismes modèles faciles à manipuler. Ces processus étant conservés entres les espèces, les résultats obtenus avec le modèle seront transposables à d’autres êtres vivants tels que l’homme. Concernant les eucaryotes, il existe des modèles phares tels que la levure, le nématode, la drosophile et la souris.

Historique de l’ARN interférence

Le nématode: Caenorabditis elegans

“antisense” experiment Cell 81, 1-20 1995 Molecule Injected % embryonic lethality ZC22 (par-1)antisense 52 ZC22 (par-1)sense 54 H20 0 Antisense RNA “Surprisingly, injection of sense ZC22 RNA also induced par-1 phenotypes. It is not clear what accounts for this effect… The basis for the sense effect is under investigation and will not be discussed further…”

RNA polymerases, although highly specific, produce some random or ectopic transcripts Molecules Injected % twitching unc-22 “pure” antisense 0 unc-22 “pure” sense 0 unc-22 sense + antisense 100 Nature 391, 806 1998

RNAi by ingesting dsRNA! - 1998 Timmons and Fire - Nature 295, 854 Bacteria expressing dsRNA GFP-expressing worms…. ….eating regular bacteria ….eating bacteria expressing GFP dsRNA

Screen for RNAi-deficient or rde mutants Tabara et al., 1999 Cell 99, 123 Craig Mello

rde-1 is evolutionarily conserved! Tabara et al., 1999 Cell 99, 123

Attempts to deepen the purple hue of petunias by genetic modification produced unexpected results. Rather than heightening pigmentation, an inserted gene switched colour production off, creating variegated blooms (inset). (Taken from Nature 404, 804 - 808)

Inactivation épigénétique post transcriptionnelle

PTGS and RNAi - a connection? Both are RNA-based gene silencing mechanisms “Posttranscriptional gene silencing occurs in plants and fungi transformed with foreign or endogenous DNA and results in the reduced accumulation of RNA molecules with sequence similarity to the introduced nucleic acid. David Baulcombe Double-stranded RNA induces a similar effect in nematodes, insects, and protozoa.” Hamilton and Baulcombe, 1999. Science 286, 952

Découverte de petits ARN complémentaires des cibles Ces ARN sont appelés small interfering RNA ou siRNA

Small interfering RNA pathways si RNAs mi RNAs pi RNAs endosi RNAs

Small interfering RNA pathway DICER Cleaves the long dsRNA to make siRNAs RISC (RNA Induced Silencing Complex) Uses the siRNAs as guides to cleave target mRNAs

Le RISC

Molecular biology central dogma RNAi pathway DNA Transcription RNA Translation Protein Cellular function

de petits ARNs régulateurs Des siRNAs aux miRNAs Un monde de petits ARNs régulateurs

miRNA Naturally occuring small RNA Cullen SR, 2005, Nature Genetics, 1163

Molecular biology central dogma miRNAi pathway DNA Transcription RNA Translation Protein Cellular function

microRNAs: “hetero-silencing” * Encoded in genome as hairpin precursors * Processed by DICER into 21-25nt RNAs * Targets loci distinct from the microRNA loci. * Degrade mRNAs with perfect match. * Block translation of mRNAs with imperfect match siRNAs: “auto-silencing” * Agents for RNAi * 21-25nt RNAs processed by DICER (in some animals a different DICER gene than that used for microRNAs) from exo or endogenous dsRNAs * Targets are RNAs from same or very similar locus * Degrade RNAs with perfect match

de petits ARNs régulateurs Des siRNAs et miRNAs aux piRNAs ou rasiRNAs Un monde de petits ARNs régulateurs

 Characteristics of Drosophila piRNAs

to Discrete Genomic Loci Drosophila piRNAs Map to Discrete Genomic Loci

The ping-pong model

Représentation schématique d’une région génomique générant un cluster de piRNAs Vagin et al., 2006, Science, 313, 320-324 Carthew, 2006, Science, 313, 305-306.

Endo siRNA NAT: Natural Antisens Transcripts Okamura and Lai, 2008

Exo-siRNA and Endo siRNA

Silencing transcriptionnel en lien avec le silencing post-transcriptionnel

Immunité intrinsèque et « silencing » Bloquer l’expression Réduire la stabilité du messager Bloquer sa traduction PTGS ou silencing post-transcriptionnel L’interférence ARN… Empêcher la transcription TGS ou silencing transcriptionnel Structure de la chromatine

Chromatin packaging into chromosomes

Structure de la chromatine et silencing transcriptionnel

Ensemble de modifications chimiques de la chromatine à déchiffrer… Le code histone Ensemble de modifications chimiques de la chromatine à déchiffrer…

RNAi et silencing transcriptionnel sont parfois liés (S. pombe) Chromatine active Éléments répétés RNAi RITS HMT Chromatine K9met ADN méthyl-transférases H3 HP1/SWI6 HDAC déacetylation H3 H3 Méthylation de l’ADN Chromatine inactive hétérochromatine Les séquences hétérochromatiques répriment leur propre expression. Les séquences hétérochromatiques peuvent réprimer en trans l’expression d’une séquence qui leur est homologue. Volpe TA, et al., 2002, 297, 1833

La voie d’ARN interférence guide le silencing de l’hétérochromatine Meth H3 Lysine4 2 6 4 Lysine 9 0.25 0.75 0.5 wt Dcr1- Rdp1- Ago1-

RNAi et silencing transcriptionnel sont parfois liés Silencing en cis URA+ Tandem repeats La voie d’ARN interférence initie le silencing de l’hétérochromatine RNAi et silencing transcriptionnel sont parfois liés

Propagation d’une structure chromatinienne compacte

Comment amplifier le signal? Transitivité Ou Comment amplifier le signal?

Targeting GFP abolishes fluorescence but also creates an unexpected, uncoordinated phenotype. Unc GFP Unc GFP This occurs because of the production of double-stranded RNA and consequently small interfering RNAs homologous to the endogenous UNC-22 gene.

Production de trans-siRNAs

ou comment distribuer le signal Systémie ou comment distribuer le signal

Green = GFP fluorescence silencing of the GFP transgene. Dispersion de l’ARNi à travers l’organisme A silencing signal moves from the veins into leaf tissue. Green = GFP fluorescence Red = chlorophyll fluorescence that is seen upon silencing of the GFP transgene. C. elegans engineered to express GFP in nuclei. Animals on the right have been treated with a control dsRNA. Animals on the left have been exposed to GFP dsRNA. Some neuronal nuclei remain fluorescent, correlating with low expression of a protein required for systemic RNAi59.

Transitivité et systémie assurent l’efficacité du contrôle par la voie RNAi

RNAi cellular function

Transposable elements mobilisation is controlled by the RNAi pathway TC1 unc-22(-) unc-22(+) transposition In some rde mutants, transposition is increased

Post-transcriptional inactivation in plants allows résistance against viruses In Arabidopsis thaliana mutants from the PTGS pathway Are sensitive to viral infections

Viral siRNAs are found in resistant plants Hamilton et Baulcombe, Science, 1999

RNAi pathway plays a role in development MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish. MZ dicer: mutant for Dicer, necessary to mature miRNA. miR-430: miRNA which contributes to tissue-specific gene expression Giraldez et al (2005), Science 308:833

Fragile X Tourette syndrome MicroRNAs likely play role in some neurological diseases Fragile X - Fragile X Mental Retardation due to loss of FMRP - FMRP binds RNAs, regulates protein translation at synapse, and is thought to regulate the expression of specific genes during neural development - FMRP fly ortholog is subunit of RISC complex Tourette syndrome - Slit and Trk-like 1 (SLITRK1) : candidate gene Frameshift mutation in the binding site for microRNA hsa-miR-189 - Abelson et al., Science. 2005, 310, 317-20.

in the Prevention of Disease Using RNAi in the Prevention of Disease

Applying RNA interference to neurological diseases Many neurodegenerative diseases are caused by toxic property of mutant proteins Polyglutamine a-Amyloide Toxic fold

A simple view of poly-Q disease Huntington disease Normal CAG repeat Normal Q repeat Normal protein folding Normal biological activity Expanded CAG repeat Expanded Q repeat Protein misfolding Toxic property

RNAi successfully acts against preformed polyglutamine aggregates Xia H. et al., Nature Biotech., 2006

VIRUS : HIV, Polyovirus, HPV, RSV, Hepatitis C Targeting viruses VIRUS : HIV, Polyovirus, HPV, RSV, Hepatitis C Traitement actuels : - drogues anti-virales mais variants résistants, toxicité - siRNAs contre ARN viral mais problème de variants résistants. Solutions possibles: - Cibler les cofacteurs cellulaires nécessaires au virus - Présence systémique de longue durée et en quantité suffisante: transduction de cellules souches hématopoietiques

Viruses can counteract the cellular defense : Viral silencing suppressors

Suppresseurs de RNAi chez les plantes : Qu F, Morris TJ: FEBS Lett 2005, 579: 5958-5964 - P1/HC-Pro codés par les potyvirus: Affecterait l’assemblage ou le ciblage du complexe RISC - Suppresseur 2b du virus mosaic du concombre: Bloque le mécanisme qui empêche l’invasion virale en bloquant la systémie. - p19 des tombus virus: s’associe aux siRNAs. Suppresseurs de RNAi chez les animaux: Li HW, Ding SW. FEBS Lett 2005, 579: 5965-5973. - B2 codé par le Flock house virus (FHV):supprime le silencing dépendant de la voie Ago2 - Tat du HIV: s’associe à dsRNAs - Tas du Primate Foamy Virus (PFV)

A Resource for Large-scale RNA-interference-based Screens Libraries of siRNA's have been generated to silence a vast number of genes in a high-throughput manner. Such applications should become more common in the future, particularly in a target-discovery context of drug-design, for example.