Tests pré-IMSI Quelles indications? Quelles conclusions? Martine COHEN-BACRIE Stéphanie BELLOC Paul COHEN-BACRIE Isabelle LICHTBLAU Anne Marie JUNCA Martine DUMONT SAMPPIL 14 Juin 2011 Laboratoire d’Eylau . Paris . Neuilly . Cherbourg

Définitions IMSI : Intra Cytoplasmic Morphological Sperm Injection MSOME :Motile Sperm Organelle Morphology Examination UMS : ultra morphologie des spermatozoïdes = TPM : test pré IMSI

Principe de l’IMSI Système optique permettant d’observer au grossissement x 6600 les SPZ mobiles Système optique avec contraste interférentiel de Nomarski objectif x100 à immersion  sélection des SPZ mobiles typiques sans vacuoles en vue de l’injection

Principe du test pré-IMSI (UMS, MSOME) Examen diagnostique x 6600 de l’ultra morphologie des SPZ mobiles après migration en GPS Observation en 3D et en temps réel des SPZ mobiles Absence d’anomalies de la base et de la pièce intermédiaire Taille/forme de la tête Vacuoles (tête)

Classification Observation au fort grossissement des SPZ mobiles x 6600 Observation (si possible) de 200 SPZ mobiles en excluant les SPZ ayant des anomalies de la PI et du flagelle Analyse de la tête du SPZ (critères de Bartoov, 2002) Classification en 4 types : Type 1 : Typiques sans vacuole Type 2 : Typiques avec vacuoles Type 3 : Atypiques sans vacuole Type 4 : Atypiques avec vacuoles

« TOP SPERMATOZOIDE » Critères de Bartoov (2002) TETE: Forme : ovale, lisse et symétrique Taille : 4,75 + 0,28µm sur 3,28 + 0,20 µm Vacuoles : zéro ou petite vacuole < 4% surface nucléaire Absence d’anomalies de la PI ou de la pièce principale du flagelle

Spermatozoïdes de 2nd choix Plusieurs Vacuoles ou une grande vacuole nucléaire 7 7 7 7

N. Sermondade, C. Sifer Gynécologie Obstétrique & Fertilité 39 (2011) 309–314

N. Sermondade, C. Sifer Gynécologie Obstétrique & Fertilité 39 (2011) 309–314

Spermatozoïde de morphologie normale x6600 x400 X400 X6600 Spermatozoïde de morphologie normale Données AMP EYLAU

Têtes spermatiques avec vacuoles de tailles différentes Données AMP EYLAU

données AMP EYLAU X 400 X 6600

Spermatozoïdes de morphologie normale données AMP EYLAU

Tri au fort grossissement x6600 - AMP EYLAU 1 Tri au fort grossissement x6600 - AMP EYLAU 1 1 2 2 X 400 2 X 6600 Données AMP EYLAU

Interprétation du TPM Nombre suffisant de SPZ mobiles après migration pour pouvoir faire l’analyse Si moins de 10% de SPZ typiques sans vacuoles  indication d’IMSI Interprétation doit tenir compte du contexte clinique masculin et féminin

Origine et signification des vacuoles Bartoov relie ces vacuoles à des anomalies du noyau spermatique Origine nucléaire? Origine acrosomique? Origine mixte?

La présence de grandes vacuoles s’accompagne: Augmentation de la fragmentation de l’ ADN (Franco et al,2008; Garolla et al,2008) Augmentation de la décondensation de l’ADN (Franco et al,2008; Garolla et al,2008;Perdrix et al,2011,Boitrelle et al, FFER 2010 ) Association avec nombreuses anomalies de l’acrosome (Perdrix et al, 2011) 17 17

Les vacuoles spermatiques sont majoritairement d’origine acrosomale O Kacem, C Sifer, V Barraud-Lange, B Ducot, et al. RBM Online 2010 Vol. 20, Issue 1, Pages 132-137 Le choix en MSOME de SPZ sans vacuoles semble correspondre majoritairement aux SPZ ayant fait leur RA ce qui pourrait constituer une explication à l’amélioration des résultats de la micro-injection par l’IMSI amélioration qui ne concerne pas les taux de fécondation mais la baisse du taux des fausses couches

Assessment of acrosome and nuclear abnormalities in human spermatozoa with large vacuoles Perdrix A, Travers A, Chelli MH, Escalier D, Do Rego JL, Milazzo JP, Mousset-Siméon N, Macé B, Rives N Hum Reprod. 2011 Jan;26(1):47-58 Vacuoles : exclusivement nucléaires (observations en MET et en microscopie confocale) Patients tératozoospermiques : augmentation des aneuploïdies et de la décondensation de la chromatine des SPZ avec de larges vacuoles Technique au bleu d’aniline

Large nuclear vacuoles are indicative of abnormal chromatin packaging in human spermatozoa Franco Jr JG, Mauri AL, Petersen CG, Massaro FC, Silva LF, Felipe V, Cavagna M, Pontes A, Baruffi RL, Oliveira JB, Vagnini LD Int J Androl. 2011 Apr 28 Technique à la chromomycine

Large human sperm vacuoles observed in motile spermatozoa under high magnification: nuclear thumbprints linked to failure of chromatin condensation Boitrelle F, Ferfouri F, Petit JM, Segretain D, Tourain C, Bergere M, Bailly M, Vialard F, Albert M, Selva J Hum Reprod. 2011 May 2 Technique au bleu d’aniline

Systèmes de réparation Chromatin Structure H2AFX (H2AX) High H2A histone family, phosphorylated after DNA damage, DNA damage signalling CHAF1A (CAF1) High Chromatin assembly in DNA replication and DNA repair Yves Menezo 2011

Statistiques 2010 17000 spermogrammes spermocytogrammes 12000 spermocultures 10000 T M S 900 tests pré IMSI (9% des TMS) 410 avec <10% SPZ type1 6000 IIU 4250 FIV 2700 ICSI 750 IMSI (27% des ICSI) Données AMP Eylau

Choix des spermatozoïdes pour l’IMSI Etude collaborative (8 laboratoires) Synthèse Antoine Béclère : N Frydman, L Hesters Bichat : L Delaroche Bondy : C Sifer Brest Pasteur : J P Velez Drouot: G Cassuto ZTP: J Pfeffer Eylau : P M Cohen-Bacrie S Belloc I Lichtblau M Dumont AM Junca C Thieulin Statistiques : J De Mouzon

Matériel et méthodes Etape 1 Etape 2 Etape 3 Distribution de 118 photos de spermatozoïdes par 2 membres du groupe Analyse des réponses de 28 biologistes sur le choix ou non de chaque spermatozoïde pour une IMSI (classification de chaque laboratoire) Etape 2 Analyse collégiale des spermatozoïdes pour lesquels le taux de concordance pour le choix (retenu pour l’IMSI ou non) est < 80 % entre les biologistes Conclusions du groupe de travail Etape 3 Validation des conclusions par l’ensemble du groupe (en cours)

Concordance entre les biologistes Taux de concordance Spz concernés Choix pour l’IMSI N % Non retenu Retenu ≥ 90 % 67 56,5 66 1 80-89 % 11 9,3 10 70-79 % 21 15,7 15 6 60-69 % 14,3 4 50-59 % 9 3 Total 118 100 103 PLUS DE 80% DE CONCORDANCE POUR 80 SPZ OBSERVES (70%) et NON RETENUS pour IMSI

Photos jerome pfeffer

Photo guy cassuto Fert ster 2008

Etape 2 Analyse des 40 SPZ pour lesquels la concordance des réponses <80 % AU FINAL : 19 SPZ finalement retenus pour l’IMSI 21 rejetés par le groupe pour Surface vacuolaire > 4 % : 17 SPZ Seule : 11 Association avec anomalie morphologique: 6 Anomalie morphologique seule : 4 SPZ

Indications Pas de consensus, aucune publication ne permet de répondre à la question des indications En pratique, test pré-IMSI utile dans : Infertilité idiopathique Après 2 échecs d’implantation en FIV/ICSI Tératozoospermie < 5% (David modifié) Fragmentation de l’ADN > 30% (TUNEL) Décondensation de la chromatine > 30% (Aniline Blue) FCS à répétition SPZ type 1 < 10% : argument pour orienter les couples vers l’IMSI

Taux de fécondation en IMSI et ICSI Selon les antécédents d’AMP Pas de différence significative dans les taux de fécondation entre IMSI et ICSI 33 33

Conclusions Pas de classifications consensuelles Nécessité d’une harmonisation inter-laboratoire des grilles de lecture et du seuil  Groupe de travail inter-laboratoire Des classifications différentes mais des résultats AMP modifiés par les types les plus péjoratifs (vacuoles+++) La signification des vacuoles n’est pas totalement élucidée Nécessité d’études prospectives pour valider les indications Le test permet une orientation vers l’IMSI qui ne peut être réalisée pour toutes les ICSI

Merci de votre attention Remerciements à toute l’équipe de techniciens et biologistes du centre AMP Eylau Et à tous les cliniciens correspondants