Introduction aux techniques de biologie moléculaire Cours M1 - 2012 Introduction aux techniques de biologie moléculaire

Analyse des protéines Expression des gènes Analyse des ARNm ADN ARNm

Analyse des interactions protéines/ADN Analyse des interactions protéines/protéines ADN ARNm Protéine Analyse des protéines Expression des gènes Analyse des ARNm

Expression des protéines  Western-blot Immunoprécipitation Immunocytochimie ELISA

Western-blot Principe: Expression des protéines Western-blot Principe:  Séparation des protéines selon leur poids moléculaire  Immunodétection de la protéine d’intérêt Étapes:  Extraction et préparation des protéines des échantillons biologiques (dosage de protéine)  Migration et transfert sur membrane  Immunodétection

Dosage des protéines: pourquoi ? Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc… Conditions différentes: - témoin, - traitement inducteur ou inhibiteur  Expression différente de la protéine d’intérêt Uniformisation des échantillons Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de l’échantillon ou le traitement reçu Dosage des protéines

Préparation des échantillons Protéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes Contrecarrer ces effets  Différenciation sur 1 seul paramètre - H2N COOH + Ebullition  dénaturation Détergent anionique lipophile (SDS)  charges négatives  solvatation + empêche précipitation Solution tampon (Laemmli) Composant sulfhydryl (β-mercaptoéthanol, DTT)  empêche régénération des ponts disulfures H2N COOH - + H2N COOH - Glycérol  augmente densité échantillon Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse) Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)

Immunodétection  Blocage des sites aspécifiques Western-blot Immunodétection  Blocage des sites aspécifiques  Incubation avec Anticorps primaires  Incubation avec Anticorps secondaires  Révélation

Blocage avec des protéines inertes Western-blot Blocage de la membrane  Blocage des sites aspécifiques: - Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween) - BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween) Blocage avec des protéines inertes X X X X Membrane

Incubation avec Anticorps primaires Western-blot Incubation avec Anticorps primaires  Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X  Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA) X Membrane Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires Membrane X

Incubation avec Anticorps secondaires Western-blot Incubation avec Anticorps secondaires  Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)  Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) Perox Perox X Membrane Perox Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires X Perox

Révélation par chemiluminescence Western-blot Révélation par chemiluminescence Ajout du substrat de l’enzyme Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière Impression d’un film photographique Révélation photo X Perox Ex: Stabilisation du facteur de transcription HIF-1α par l’hypoxie Normoxie Hypoxie

Western-blot: Résumé  Extraction et préparation des échantillons - Protection vis-à-vis des protéases - Dosage - Dénaturation  Electrophorèse - Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids moléculaire) - Transfert sur membrane  Immunodétection - Blocage des sites aspécifiques - Incubations avec Ac 1aire puis 2aire - Révélation

Western-blot Immunoprécipitation Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à des anticorps (ex: Protein G) Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée Western-blot Interactions protéines-protéines, protéine-médicament Concentration d’une protéines présente en faible quantité

Immunocytochimie Immunocytochimie Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique d’immunofluorescence Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques Utilisation d’un fluorochrome couplé à: - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte Ex: Mise en évidence du cytosquelette Anticorps 1aire anti-tubuline Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine

Immunocytochimie: Méthode Cellules en culture Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS Perméabilisation au Triton X-100 (0,05%) Analyse au microscope Anti-actine Anticorps 1aire (une nuit – 4°C) X Blocage des sites aspécifiques (BSA 3%) Iodide de propidium contre-coloration du noyau Anticorps 2aire couplé au fluorochrome Lavages au PBS

Immunocytochimie: exemple Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor) - Présence O2  cytoplasmique Absence O2  nucléaire  transcription de gènes nécessaires à la survie cellulaire Fibroblastes de membrane synoviale humains + mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h Témoin CoCl2

Les fluorochromes Exemples DAPI Excitation à 365 nm; émission à 420 nm Immunocytochimie Les fluorochromes Exemples DAPI Excitation à 365 nm; émission à 420 nm Contre-coloration de fond des noyaux Fluorescence bleue FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm Fluorescence verte TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm Fluorescence rouge

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO Méthode d’analyse des cellules in situ dans les tissu Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques Utilisation un anti corps secondaire couplé à une enzyme (HRP ou ALP) Utilisation un anti corps secondaire couplé d’un fluorochrome - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO Détection du collagène type deux Révéler par ALP coloration rouge Détection du GFAP Révéler par fluorescence

Les differents type de microscopie

. ELISA ELISA

Expression des gènes Étude de l’expression Extraction des ARNs Reverse Transcriptase PCR semi quantitative et quantitative Blocage de l’expression  siRNA

= Précipitation ARN à -20°C Extraction d’ARN Extraction d’ARN Cellules en culture Enlever le milieu de culture Ajouter le Trizol Gratter avec une spatule Récupérer dans un tube Conservation à -80°C Dosage à 260 nm Ajout Chloroforme Resuspension dans l’eau UP Lavage à l’Ethanol 70°C Vortex Incubation sur glace Phase aqueuse = ARN totaux Centrifugation Ajout Isopropanol = Précipitation ARN à -20°C Centrifugation Culot d’ARN Protéines Phénol + Chloroforme = Débris cellulaires

Transcription inverse (1) ARN  ADN complémentaire Molécule moins fragile Conservation à -20°C Sélection des ARNm Matrice pour la réaction d’amplification Enzyme  Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN

Transcription inverse (2) Kits commerciaux avec: - Enzyme + tampon d’activité - dNTPs en quantité suffisante - DTT  élimination des structures 2aires des ARNs - Amorces polydT  sélection des ARNm 10 min à 70°C DTT AAAAAAAA TTTTTTTTT Amorce oligo dT AAAAA ARNm 1h – 37°C 15 min – 70°C TTTTTTTTT ADNc

Polymerase Chain Reaction (PCR) Méthode d’amplification génique in vitro Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (pg) d'acide nucléique Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse (20 à 25 nucléotides)  obtention d’un amplicon de taille connue Basée sur: L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température

PCR PCR: étapes d’un cycle

PCR: en pratique Animation Flash Au final, on obtient un très grand nombre de copies du gène d’intérêt, visualisables sur gel

PCR: dépôt sur gel Gel d’agarose = maillage Plus solide et moins toxique que l’acrylamide ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire) Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant) - Ajouté lors de la préparation du gel - En solution dans laquelle le gel est plongé après migration M échantillons

PCR quantitative ou en temps réel A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale d’ADN cible 2 techniques: - agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green) - sondes fluorescentes (ex: Taqman) 2 conditions: - Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin - Pas d’inhibition de la réaction de PCR

PCR PCRq: SYBR Green Étape de dénaturation: le colorant libre émet peu de fluorescence Étape d’hybridation et d’élongation:  fluorescence associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence est observée pendant l’étape de polymérisation et l’émission fluorescente décroît complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante Conséquemment, l’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun des cycles par un système de lecture intégré à l’appareil de PCR en temps réel qui permet de suivre l’augmentation de la quantité d’ADN amplifié durant la réaction  Étape de dénaturation: extinction de la fluorescence Mesure à la fin de l’étape d’élongation

PCRq: SYBR Green Avantages: Utilisation simple Pas de sonde Nécessité d’amorces spécifiques Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible Inconvénient Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin  Visualisation des produits aspécifiques

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR.  Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine). Étant donné que l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase est spécifique à l’ADN double brin, les sondes libres en solution demeurent intactes et aucune fluorescence n’est émise. Lors de l’étape d’hybridation, la sonde et les amorces se fixent à leurs séquences complémentaires respectives. A l’étape suivante, la Taq polymérase débute l’élongation du nouveau brin d’ADN à partir de l’amorce jusqu’à ce qu’elle rencontre sur son passage la sonde hybridée qu’elle déplace et hydrolyse avec son activité 5’-exonucléasique. Le reporter est alors libéré de l’environnement du suppresseur permettant ainsi l’émission de fluorescence qui augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde Seul moyen d’obtenir de la fluorescence est de séparer le fluorochrome du quencher = plus de transfert d’énergie = émission de fluo  Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que d’émettre de la fluorescence.

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde Hybridation de la sonde Fixation de l’amorce et élongation Hydrolyse de la sonde  Émission de fluorescence L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde Précautions: Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime la fluorescence de l’émetteur même après clivage Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation Avantage:  Plus spécifique Inconvénient:  Pas idéale pour la détection des mutations Comme la Taq polymérase hydrolysera la sonde seulement lorsque celle-ci est hybridée à sa séquence complémentaire, les conditions de température de l’étape de polymérisation doivent être ajustées de façon à permettre à la sonde de rester hybridée durant cette étape. La majorité des sondes ont une température de dissociation (Tm) autour de 70ºC ou de 5 à 10 oC plus élevée que les amorces. Par conséquent, la technologie Taqman utilise une étape combinée d’hybridation et de polymérisation à 60-62ºC assurant l’hybridation et la stabilité de la sonde durant l’extension. Ceci permet aussi une activité 5-exonucléasique maximale de la Taq polymérase mais, l’efficacité de l’activité de

PCRq: Cycle seuil (Ct) PCR Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité d’amplicons produits à un instant précis Plus il y a de matrices à amplifier au départ de la réaction de PCR, moins élevé sera le nombre de cycles requis pour atteindre un point où le signal d’émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond) Par conséquent, la quantification n’est pas affectée par l’épuisement d’un des réactifs comme lors de la phase plateau ce qui explique pourquoi le système en temps réel est si reproductible. La valeur du Ct peut être traduite en un résultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du Ct générées avec des matrices de quantification connues (Bustin, 2000). Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification.

PCRq: Courbe de fusion « Melting curve » Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin. Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification 45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en continu

PCRq: Courbe de fusion « Melting curve » Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température Vérification de la spécificité des sondes

PCRq vs PCR classique Quelques ng d’ADN suffisent Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30) Sensibilité Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue) Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps

Autre aplication de la qpcr

Etude interaction proteine proteine Co Immuno précipitation Fret colocalisation

Etude interaction proteine adn gemsa ship Trans activation

Régulation expérimental de l’expression des gène Transfection Si RNA

Les animaux transgenic Transgenique Ko Et conditionelle

Conclusions Importance des outils de la biologie moléculaire Etude de l’expression génique - Transcriptionnel (ARNm) - Traductionnel (Protéines) Etudes de localisation - Localisation fonctionnelle - Physiologique vs pathologique ne correspondent pas toujours Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante - Spécificité (anticorps, amorces, etc…)

Les ARN double brins présents dans une cellule sont tout d'abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l'« éminceuse ». Celle-ci clive l'ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les siRNA à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Un des brins du siRNA, dit passager, est éliminé tandis que l'autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le siRNA et l'ARNm cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et n'est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage. Ce mécanisme est donc très spécifique de la séquence du siRNA et de sa cible, l'ARNm. Dans certains cas, on peut choisir un siRNA capable de cliver un ARNm porteur d'une mutation ponctuelle sans affecter l'ARNm sauvage.