Echelle d’observation 1 AC Schmit (2003) DEUGB2 Dynamique et Régulation Cellulaire Echelle d’observation Taille But Observation Tissu Anatomie Oeil nu, loupe Petits organismes, organes, Histologie Microscope photonique Tissus Cytologie Microscope photonique contraste de phase, confocal Cellules isolées Morphologie intracellulaire Microscope électronique Organites, virus, macromolécules Niveau moléculaire Microscopie à effet tunnel, à champ proche AFM Molécules Niveau atomique Microscopie à effet tunnel, “field ion microscope” FIM Atomes 1mm 100µ 10µ 1µ 0,1µ 10nm 1nm 1A

Caractéristiques de la lumière 2 Caractéristiques de la lumière Fréquence (F) = nombre d’onde par seconde (Hz) F = Vitesse de la lumière = V ex: 300.000 km/sec = 0,6 x 1015 Hz longueur d’onde l 500 x 10-12 km F A Intensité = proportionnelle à l’amplitude (A) l Longueur d’onde (l) = phase Ondes électromagnétiques visibles (400nm ≤ l ≤ 700nm) P (sens de propagation)

Les ondes électromagnétiques 3 Caractéristiques de la lumière Les ondes électromagnétiques UV < 400nm -Lumière visible- 700nm < IR Hz m

La réflexion diffuse 4 B V R V R Propriétés de la lumière Vide Distance parcourue en 1 seconde Vide 300.000 km Eau 225.000 km Verre 200.000 km Diamant 125.000 km B V R V R

Réfraction de lumière et microscopie objectif Lamelle Échantillon lame 1,52 1,00 n Réfraction de lumière et microscopie Objectif à sec air } Objectif à immersion à huile huile Propriétés de la lumière 5

La diffraction de la lumière 6 Propriétés de la lumière La diffraction de la lumière Rayons non déviés d Rayons diffractés 1er et 2ème minimum Rayons non déviés 1er pic Sinq = 1,22 l/d

Distance minimale de résolution en microscopie photonique 7 Propriétés de la lumière Distance minimale de résolution en microscopie photonique L’ouverture numérique de l’objectif ON ≈ sin q Sinq = 1,22 l/d ON = 0,61 l/R dm1 dm2 20% R1 R2 si ON = 0,25  R1 = 0,61 l/0,25 si l = 500nm  R1 = 1220nm = 1,22 µm si ON = 1,4  R2 = 0,61 l/1,4 si l = 500nm  R2 = 218nm = 0,22 µm

Schéma récapitulatif de la dynamique chromosomique 8 Schéma récapitulatif de la dynamique chromosomique Interphase Phase G1 Phase S Phase G2 Mitose Prophase Prométaphase Métaphase Anaphase Telophase

Polarisation et biréfringence 9 Polarisation et biréfringence Analyseur Echantillon Polariseur

Comment agrandir l’image de l’échantillon ? 10 Comment agrandir l’image de l’échantillon ? Image d’un objet situé entre la lentille et le plan focal f1 lentille Image virtuelle agrandie  Grossissement de l’image

6. Eclairement optimal de l’échantillon 11 6. Eclairement optimal de l’échantillon objectif échantillon Diaphragme d’ouverture Condenseur Diaphragme de champ lentille collectrice lampe

Le trajet optique en lumière transmise 12 Le trajet optique en lumière transmise observateur oculaires tube optique objectif platine-objet diaphragme d’ouverture condenseur diaphragme de champ lentille collectrice source de lumière Eclairement optimal de l’échantillon

Principe du contraste de phase Principe du fond noir 13 Types d’observation Principe du contraste de phase Principe du fond noir +1/2 l l +1/4 l plaque de phase Anneau de phase

Contraste interférentiel différentiel DIC 14 Contraste interférentiel différentiel DIC Prisme 2 1/2 l 2 3 1/4 l 4 l 1 polariseur analyseur Prisme 2 Prisme 1 échantillon Prisme 1 blanc noir gris 1/2 l l 1/4 l

Trajet optique de la lumière 15 Trajet optique de la lumière Le microscope à épifluorescence

La GFP : green fluorescent protein Aequorea victoria 26 kDa (238 aa) fluorochromes 16

Variété des sondes Alexa Les fluorochomes synthétiques fluorochromes 17

 Les Blocs Filtres 18 filtre d’arrêt (émission) filtre d'excitation Le microscope à épifluorescence  Les Blocs Filtres filtre d’arrêt (émission) filtre d'excitation lampe HBO miroir dichroïque

Filtres et fluorochromes 19 Le microscope à épifluorescence Filtres et fluorochromes Emission : BP510-540 Excitation : BP460-500 Alexa 488 Excitation : BP520-550 Emission : BP580-630 TRITC 400 500 600 700 nm

20 Distribution des microtubules au cours du cycle cellulaire Cytosquelette Distribution des microtubules au cours du cycle cellulaire dans une cellule animale et dans une cellule de plante Cellule animale Cellule de plante Interphase Phase G2 Prophase Anaphase Télophase

Comparaison avec le microscope à fluorescence conventionnel 21 B C pinhole Comparaison avec le microscope à fluorescence conventionnel p O A p’ Principe du microscope confocal

Balayage de l’échantillon 22 Balayage de l’échantillon y x z Miroir de balayage y Miroir de balayage x Plan focal Le microscope confocal

Amplification du signal lumineux par photomultiplicateur 23 Amplification du signal lumineux par photomultiplicateur PMT laser Plans focaux l1, l2, l3 prisme Miroir dichroïque Système de détection Le microscope confocal

24 Interaction protéine-protéine ou changements conformationnels FRET Excitation Emission Interaction protéine-protéine ou changements conformationnels Applications 24

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS Séparation de cellules isolées par Cytométrie de flux • L’une des premières applications fut l’analyse du cycle cellulaire par quantification de l’ADN Applications 25

• Hétérodimères de tubulines 26 Dynamique microtubulaire Microscopie électronique • Hétérodimères de tubulines a et b microtubules + - 37°C, GTP Structure du dimère Hétérodimère de tubulines a et b a-tubuline b-tubuline - + 0°C, Ca++ + -

Dynamique des dimères de tubuline 27 Dynamique des dimères de tubuline catastrophe GTP GDP sauvetage pause FRAP

MBD : Domaines de liaison à la tubuline 28 Organisation moléculaire et distribution d’une MAP N-Term C-Term MBD : Domaines de liaison à la tubuline

+ - 29 Transports de cargos cargo queue tête motrice KINESINES DYNEINES + - cargo queue tête motrice Transports de cargos Cargos : • vésicules • complexes protéiques • complexes nucléoprotéiques

30 Wu et al. (2000) Nature Struct. Biol. 7 : 575-579 4 3 2 1 T 0 T1 - + Asaï et Koonce (2001) Trends Cell Biol. 11: 196-201. Dynéine

31 C-term motors N-terminus C-terminus R. A. Milligan The Mechanism of Action of Molecular Motors http://www.scripps.edu/milligan/home.html Hoenger et al. (2000) J Mol Biol 297: 1087-1103 http://www.mpasmb-hamburg.mpg.de/ktdock/ C-term motors N-terminus C-terminus

VI. Le cytosquelette d’actine et ses protéines associées 32 VI. Le cytosquelette d’actine et ses protéines associées 1. Assemblage polarisé de monomères d’actine (-) (+) Curr. Opin. Cell Biol. 2003, 15 : 14-22 Décoration par méromyosine

33 Actine et motilité cellulaire dans la cellule animale

34 Actine en mitose Cellule animale

35

36 VII. Les filaments intermédiaires 1. Organisation des polymères

VIII. Trafics vésiculaires 37 VIII. Trafics vésiculaires 1. Schéma général du système endomembranaire

38 Siège de synthèses protéiques COP coat

39 Schématisation tridimensionnelle, par reconstitution à partir de coupes sériées de microscopie électronique

Les transports entre le RE et le Golgi 40 Les transports entre le RE et le Golgi RE cis COP II COP I Buchanan et al Fig1.23

41 Cellules animales en culture : - 2% de la surface du plasmalemme - Durée du phénomène : une minute Quantité 2500 vésicules/min - >1000 récepteurs/vésicule, concentrant les cargos spécifiques internalisés

(Dynéine, Cterm-Kinésine) 42 MTs MFs + end motor (Nterm-Kinésine) - end motor (Dynéine, Cterm-Kinésine) Myosines non conventionnelles . . . . . . . . . . . D’après Fath et Burgess (1996) Curr. Top. Memb. 43: 53-71.

43 7. Cytocinèse chez les plantes : fusion de vésicules golgiennes à l’équateur du phragmoplaste en télophase

Présence de protéines motrices de type kinésine à l’équateur 44 Présence de protéines motrices de type kinésine à l’équateur At PAKRP1 Colocalisation partielle At PAKRP2 Dapi Lee et al. (2001) Plant Cell 13: 2427-2439.