Rôle du monoxyde d’azote dans la vasomotricité lors du choc septique: CONSERVATOIRE NATIONAL DES ARTS ET METIERS CENTRE REGIONAL RHÔNE-ALPES CENTRE D'ENSEIGNEMENT DE LYON ___________________________________________ ORAL du mémoire de stage de BIOLOGIE présenté par Anne LECUYER Rôle du monoxyde d’azote dans la vasomotricité lors du choc septique: études utilisant des modèles murins Madame, Messieurs, j’ai le plaisir de vous présenter le rôle du NO dans la vasomotricité lors du CS via des études utilisant 2 modèles murins: la souris et le rat. Soutenu le 12 novembre 2008, à Lyon, devant le jury : Président  : M. Philippe POCHART Examinateur : M. Hubert PINON Invités : Mme Jeanne Marie BONNET M. Stéphane JUNOT Anne LECUYER Cnam de Lyon

- + + Agent infectieux (choc septique ) Médiateurs de l’inflammation TGF-β iNOS - NO Lors de l’introduction d’un agent infectieux (le + svt une bactérie) lors du CS, il se produit une cascade inflammatoire où sont mis en jeu des médiateurs tels que le TNF, l’interleukine 1 ou le LPS qui vont stimuler une enzyme inductible (la iNOS) qui va produire le NO. Celui-ci a un effet vasodilatateur qui est à l‘origine de défaillance multiviscérale consécutive à l’hypotension. En parallèle, la production de TGF-béta est stimulée par ces médiateurs de l’inflammation et ce dernier a un effet de feedback négatif sur la iNOS. Hypotension – baisse perfusion (foie, rein, intestin) Défaillance multiviscérale D’après Zamora & Vodovotz 2005 Anne LECUYER Cnam de Lyon

Etudes murines expérimentales PLAN Rappels Le choc septique Le monoxyde d’azote Le TGF-β Etudes murines expérimentales Caractérisation phénotypique hémodynamique de souris invalidées pour la voie du TGF-β Altérations de la circulation systémique et de la microcirculation ainsi que la production de monoxyde d’azote chez le rat Cette présentation va se découper en 2 parties. Tout d’abord de brefs rappels bibliographiques puis les résultats obtenus lors des études expérimentales. C’est pourquoi je suivrais le plan suivant : Dans un 1er temps, nous évoquerons comment en partant d’un symptôme inflammatoire qu’on appelle le SIRS, on arrive à un choc septique avec les médiateurs qui sont impliqués, le rôle fondamental des enzymes que sont les NOS et leur produit, le NO qui est au centre des altérations vasomotrices rencontrés lors du CS puis l’action que semble avoir le TGF-β sur la iNOS. Dans un second temps, les études expérimentales seront développées. Tout d’abord, … puis les altérations… Anne LECUYER Cnam de Lyon

Rappels Anne LECUYER Cnam de Lyon

Infection initiale très variée: bactériémie dans 40 à 60 % des cas 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- CONCLUSION c- Le TGF-β Infection initiale très variée: bactériémie dans 40 à 60 % des cas Dernier stade d’un syndrome inflammatoire Phénomène complexe Stabilité du taux de mortalité globale (56%) dans le temps malgré les progrès de la médecine Incidence : environ 40 000 cas par an en France Partant d’un syndrome inflammatoire (une bactérie dans 40 à 60% des cas), l’organisme peut évoluer vers un choc septique en passant par différents stades dont la gravité augmente. Le SIRS est un syndrome de réponse inflammatoire systémique défini par mini 2 symptômes (en particulier une hyperdermie, une augmentation de la PA ou de la fqce respiratoire). Cet syndrome peut évoluer en sepsis qui est un SIRS + infection documenté. Il peut évoluer en sepsis sévère (sepsis + dysfonction d’un ou plusieurs organes). Dans les cas les plus graves, on aboutit au CS qui est une aggravation du sepsis sévère avec hypotension artérielle réfractaire au remplissage vasculaire. Le CS est un phénomène complexe dont le taux de mortalité est stable malgré les progrès de la médecine et qui tue encore 40000 personnes par en an France. Anne LECUYER Cnam de Lyon

Physiopathologie partiellement comprise : 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- CONCLUSION c- Le TGF-β Physiopathologie partiellement comprise : Libération d’endotoxines dans le sang Activation du système immunitaire Réponse inflammatoire: libération de plusieurs médiateurs inflammatoires (cytokines: interleukines ou le tumor necrosis factor) Cascade inflammatoire Réponse inflammatoire inappropriée Syndrome de défaillance multiviscérale Décès La physiopatho du CS n’est encore que partiellement comprise. La libération d’endotoxines dans le sang (dans le cas d’une bactériémie) active le système immunitaire via le complément et stimule la libération de nombreux médiateurs inflammatoires telles que les cytokines (IL, TNF) mais également d’autres médiateurs mis en jeu (NO, PGI2). De cette cascade inflammatoire, est engendrée une réponse inflammatoire inappropriée qui va activer en particulier les NOS et pouvant entrainer un syndrome de défaillance multiviscérale voir le décès. Anne LECUYER Cnam de Lyon

Monoxyde d’azote Produit par l’enzyme nitric oxide synthase (NOS) 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- CONCLUSION c- Le TGF-β Monoxyde d’azote Produit par l’enzyme nitric oxide synthase (NOS) Trois isoformes Constitutives La forme endothéliale (eNOS) La forme neuronale (nNOS) Inductible (iNOS) Le NO est produit par l’enzyme nitric oxide synthase (NOS). Ces NOS sont des enzymes présentes dans différents types cellulaires dont les cellules endothéliales qui sont capables, lorsqu’elles sont activées à partir de L arginine et d’O2 de produire du NO et de la citrulline. un certain nombre de cofacteurs comme le FAD ou le FMN participe à la réaction. Il existe trois isoformes de la NOS. Parmi ces trois isoformes, deux sont retrouvés de façon constitutive, la forme endothéliale et la forme neuronale alors que la troisième est inductible (iNOS). Les formes constitutives sont continuellement exprimées et produisent du NO en faible concentration alors qu’une fois induite, la iNOS demeure active durant 4-24h et produit près de 100 fois plus de NO que les cNOS. Anne LECUYER Cnam de Lyon

NO SYNTHASE ENDOTHELIALE NO SYNTHASE INDUCTIBLE 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- CONCLUSION c- Le TGF-β NO SYNTHASE NEURONALE (nNOS) NO SYNTHASE ENDOTHELIALE (eNOS) NO SYNTHASE INDUCTIBLE (iNOS) (ou macrophagique) Activation Dépendante de l’augmentation du calcium intracellulaire Calcium indépendante Contient la calmoduline Type d’induction Enzymes constitutives Enzyme majoritairement inductible (IL-1, TNF, LPS, …) Formes constitutives ? Cellules Neurones du SNC, du muscle squelettique et du myocarde, … Cellules des ilots pancréatiques, de la macula densa, épithéliales, … Cellules endothéliales vasculaires essentiellement Myocytes cardiaques Neurones CA1 (potentialisation à long terme) Presque toutes les cellules après induction: Macrophages, neutrophiles, hépatocytes, CMLv, chondrocytes, cellules endothéliales, myocytes cardiaques, … Action(s) menée(s) Neurotransmission Vasodilatation Inhibition de l’agrégation plaquettaire Immunité Inflammation L’activation des cNOS dépend de l’augmentation du calcium intracellulaire contrairement à la iNOS. On retrouve la nNOS dans …, la eNOS dans … et la iNOS… Leur action est … Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Le choc septique. 2- ETUDES expérimentales 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- CONCLUSION c- Le TGF-β Effet du TGF-β sur l’hypotension induite par les LPS chez le rat Perrella et al., 1996 Ce graphique présente les résultats de Perrella et al (1996) suite à l’administration de TGF-b chez des rats en CS. Chez les rats du groupe contrôle, la PA est stable, de même que lors de l’injection de TGF seul. L’injection de LPS provoque une diminution rapide de la PA entrainant le décès de l’animal. L’administration de TGF chez les rats ayant reçu une injection de LPS se fait après une baisse de 25% de la PA moyenne. On remarque une augmentation significative de la PA.

TGF- inhibe production NO par iNOS 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion Peut prévenir la chute de tension chez des rats en choc septique N’induit pas d’hypertension après injection Le TGF- inhibe l’expression de la iNOS Mécanisme et hypothèses? TGF- inhibe production NO par iNOS Maintien de la PA dans le choc septique Effet différentiel iNOS/cNOS Pas d’action sur la NOS constitutive? Pas de suivi de la cinétique du NO actuellement Le TGF bêta est une cytokine pro-fibrosante on sait par ailleurs que le tgf b inhibe l’expression de la iNOS. Perrella en 1996 a montré que l’administration de tgf b chez des rat en choc septique était susceptible de prévenir la chute de tension en moins de 90 min, en revanche quand il était administré seul le tgf n’induisait pas d’hypertension. Le mécanismes de ces effet précoces restent à explorer les auteurs n’ayant pas suivi la production du NO chez ces sujets. Une action par la iNOS pourrait être évoquée, on peut aussi supposer que le tgf n’agirait pas sur la NOS constitutive

Déception / traitements 1- RAPPELS a- Le choc septique 2- ETUDES expérimentales b- Le monoxyde d’azote 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Le TGF-β d- Conclusion Progrès importants dans la compréhension des mécanismes du choc septique depuis 15 ans Déception / traitements Recherche de nouvelles pistes thérapeutiques: voies des NOS et du TGF-β Anne LECUYER Cnam de Lyon

Etudes expérimentales murines Anne LECUYER Cnam de Lyon

1ère étude: Caractérisation phénotypique hémodynamique de souris invalidées pour la voie du TGF-β dans les cellules musculaires lisses vasculaires Anne LECUYER Cnam de Lyon

Préparation chirurgicale 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Préparation chirurgicale Pression artérielle carotidienne Injection de sérum physiologique ou LPS

60 souris C57BL/6 mâles par groupe de 10 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion 60 souris C57BL/6 mâles par groupe de 10 Protocole 1 : caractérisation hémodynamique Groupe 1 : souris témoins  Groupe 2 : souris KO / TGF-β Protocole 2 : création d’un choc septique Groupe 3 : souris témoins recevant du LPS Groupe 4 : souris témoins recevant du sérum physiologique Groupe 5 : souris KO recevant du sérum physiologique Groupe 6 : souris KO recevant du LPS Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion PA moyenne de base: 80,2 ±2,3 mmHg FC moyenne de base: 319 batt/min Dans cette étude, sont mesurés les % entre les valeurs de base (PA= 80,2 ±2,3 mmHg et FC= 319 batt/min) et les valeurs obtenues après l’injection de chacun des vasoconstricteurs. L’injection de sérum physiologique n’a pas entrainé de modification de la PA et de la FC. On remarque que pour l’ensemble des VC, on obtient une augmentation importante de la PA puis un retour à la PA de base après injection. Concernant la FC, hormis pour l’injection d’Ang II qui provoque une augmentation de la FC, les autres VC provoquent une baisse de la FC. Seule la baisse de la FC suite à l’injection de L’Name est statistiquement significative et on a également une tendance à la significativité pour la Phe et l’ET-1. * Variation de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque à l’injection de vasoconstricteurs : angiotensine II (1 µg/kg), phényléphrine (100 µg/kg), endothéline-1 (7,5 µg/kg) et L-NAME (50 mg/kg) chez 10 souris C57BL/6 Anne LECUYER Cnam de Lyon

Choix de l’anesthésiant 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Choix de l’anesthésiant Variation importante de la PA après l’injection des vasoconstricteurs liés à la stimulation de récepteurs sauf pour le L-Name Bradycardie réflexe pour tous les vasoconstricteurs sauf l’angiotensine II Le choix de l’anesthésiant est pertinent car le modèle animal est stable; la durée d’anesthésie est suffisamment longue et surtout comme on mesure des % de variation le léger effet dépresseur cardiovasculaire qu’il provoque ne gène pas. Variation importante de la PA après l’injection des vasoconstricteurs liés à la stimulation de récepteurs (AT1 pour l’angiotensine, l’ETA pour l’endothéline et récepteur α pour la phényléphrine) sauf pour le L-Name (inhibiteur de la synthèse du NO) L’injection des substances provoque un bradycardie liée à l’hypertension induite par les VC et la mise en jeu du baroréflexe. L’angiotensine II a une action spécifique sur le baroréflexe en diminuant la bradycardie reflexe. Anne LECUYER Cnam de Lyon

2ème étude: Étude des altérations de la circulation systémique et de la microcirculation ainsi que la production de monoxyde d’azote chez le rat Wistar Anne LECUYER Cnam de Lyon

ALTERATIONS TISSULAIRES 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion NO ELECTRODES A NO Injection de LPS Paramètres cardio- vasculaires ARNm TISSUS Foie, reins, aorte, … SANG Laser Doppler FOIE Effets régionaux microcirculation hépatique Carotides DEBIT AORTIQUE Débitmétrie (ultrasons) Pression artérielle carotidienne Effets systémiques Anesthésie gazeuse + Oxygène Débit carotidien ALTERATIONS FONCTIONNELLES CIRCULATOIRES ALTERATIONS TISSULAIRES Anne LECUYER Cnam de Lyon

Evaluation de la survie au choc septique 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Trois groupes de rats Rats témoins Rats traités au Tamoxifène (↗ TGF-β) Rats + TGF-β Evaluation de la survie au choc septique Cinétique de la production de NO Altérations macro- et microcirculatoires Lésions tissulaires Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale. 2- ETUDES expérimentales 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Dans cette étude, sont comparées les fluctuations des paramètres entre les rats du groupe contrôle (injection de sérum physiologique) et ceux du groupe LPS (injection de LPS). Ce 1er graphe montre l’évolution de la PA, du DC et du DH après injection de 10 µl de physio. En abscisse se trouve le tps et en ordonnées les variations des paramètres. L’injection de phy n’a pas entrainé de modification significative des paramètres. La fréquence cardiaque des rats du groupe témoin reste stable Variations des paramètres hémodynamiques pour les 5 rats Wistar du groupe contrôle après injection de 10 µl de sérum physiologique Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale. 2- ETUDES expérimentales 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Dans le groupe LPS, la période témoin est également stable (PA de base: XX mmHG) Après l’injection de LPS, on remarque une forte augmentation de la PA( +42,7%) et du DC (+85,75%) dans les 6 min suivant l’injection puis une chute jusqu’à atteindre n valeur nulle autour de 45 min. Concernant le DH, il n’y a pas d’augmentation du débit mais également une diminution à partir de 6 min et ceci jusqu’à atteindre une valeur nulle à 42 min après injection. Variations des paramètres hémodynamiques pour les 5 rats du groupe LPS Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion L’injection de LPS entraine une variation significative de la FC (jusqu’à une augmentation de 145% au bout de 42 min) par rapport à la FC de base. Comparaison de la fréquence cardiaque entre les rats du groupe contrôle et ceux du groupe LPS Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale. 2- ETUDES expérimentales 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Le fait de calculer les résistances périphériques permet d’avoir une idée de la vasomotricité au niveau systémique et de l’état de perfusion des organes. Dans notre cas, nous mesurons les résistances systémiques à partir de la PA et du DC ainsi que les résistances microcirculatoires ave le DH. Si on voulait être totalement rigoureux, nous aurions mesurer la PA hépatique (ici PA carotidienne) mais cela n’était pas réalisable. Dans notre étude, on note une augmentation des résistances systémiques (entre 3 et 9 min) et hépatiques (entre 6 et 18 mois) avant la chute de celles-ci. Evolution des résistances périphériques carotidien et hépatique chez les 5 rats du groupe LPS Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS. a- Préparation chirurgicale 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion La production de NO au cours du temps, chez les rats du groupe témoin, est stable (> 1% d’augmentation) alors qu’après 6 min après l’injection de LPS, on a une production massive de NO (+956%) jusqu’à 21 min suivie d’une décroissance. Variation de la production de monoxyde d’azote hépatique chez des rats Wistar Anne LECUYER Cnam de Lyon

Modèle stable dans le temps et entre individus 1- RAPPELS a- Préparation chirurgicale 2- ETUDES expérimentales b- Protocole 3- RESULTATS ESCOMPTES c- Résultats d- Discussion Modèle stable dans le temps et entre individus Chute rapide des paramètres hémodynamiques après injection de LPS (PA, DC, DH) Léger décalage entre les pics des résistances (RC<RH) Production rapide de NO après injection de LPS Anne LECUYER Cnam de Lyon

1- RAPPELS 2- ETUDES expérimentales 3- RESULTATS ESCOMPTES Proposer de nouvelles thérapeutiques médicales en rapport avec le NO et le TGF-β susceptibles de moduler les réponse macro- et microcirculatoire pour améliorer le pronostic souvent sombre des patients en choc septique

Structure des vaisseaux - Tunique interne : intima - Tunique moyenne : média - Tunique externe : adventice (tissu conjonctif, vasa-vasorum) Endothélium Intima Membrane basale Cellules musculaires lisses Media Fibres d’élastine Adventice Tissu conjonctif, vasa-vasorum http://www.med.univ-angers.fr/etudiant/masters/M1/Cours_M1_la_circulation_demiot.pdf Anne LECUYER Cnam de Lyon

Défaillance cardio-vasculaire Diminution des résistances vasculaires, associée à une défaillance myocardique Hypovolémie relative ou absolue (fuite plasmatique) Hyporéactivité vasculaire aux catécholamines Anomalie de l'extraction périphérique de l'oxygène. Anne LECUYER Cnam de Lyon