Insuffisances ovariennes prématurées (IOP) Pr Sophie Christin-Maitre Endocrinologie de la reproduction Hôpital Saint-Antoine Centre de maladies endocriniennes rares CMERC Université Pierre et Marie Curie, EA 1533 Paris

Insuffisance ovarienne prématurée (IOP) Aménorrhée primaire ou aménorrhée secondaire de plus de 6 mois Avant l’âge de 40 ans Gonadotrophines FSH> 40 mUI/ml

NOMBRE DE FOLLICULES PRIMORDIAUX 300 000 5ème mois intra-utero 37 50 ans

Perte folliculaire physiologique Gougeon, Ecochard, Thalabard 1994 Biol Reprod

Faddy 2000 Mol Cell Endocrinol 163; 43-8

Age de survenue de la ménopause (Torgerson, 1997) > 45 ans : 88% femmes 40-45 : 9,7% < 40 : 1,9%

Le risque de ménopause avant 40 ans Pas de liaison satistiquement significative avec : âge de la ménarche utilisation de contraception orale le tabagisme l’éducation BJOG, 2003; 110 : 59-63

Insuffisance ovarienne prématurée (IOP) : Etiologie inconnue dans plus de 90% des cas en dehors de la chimiothérapie, de la radiothérapie et de la chirurgie

Insuffisance ovarienne prématurée (IOP) : Origine génétique ?

Gènes et ménopause physiologique Pythagore (580-500 av. J.C) nubilité âge critique puberté 21 42 14 7 ans 49 ans perte de la faculté de concevoir

Gènes et ménopause physiologique Corrélation entre l’âge de survenue de la ménopause entre mère et fille Cramer, Fertil Steril 1995 ; 64: 740 Etude de cohorte de jumelles en GB: 628 paires, origine génétique 63% Snieder, J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 1875

2004 : 1ère étude du génome Etude de familles hollandaises avec des femmes ayant un âge de ménopause très discordant ou très concordant 165 familles Van Asselt KM Am J Hum Genet 2004; 74: 444

Van Asselt KM Am J Hum Genet 2004; 74: 444

Liaison : Xp21.3 +++ LOD score 3,1 9q21.3 LOD score 2,6 => X CHROMOSOME Van Asselt KM Am J Hum Genet 2004; 74: 444

dans 5 à 20% des cas selon les différentes études Cas familiaux d’IOP dans 5 à 20% des cas selon les différentes études

Identification d’anomalies génétiques chez des femmes avec IOP

MECANISMES DE L’IOP Atrésie > 120 71 14 jours ?? Préovulatoire Antraux Préantraux Secondaires Primaires Atrésie Primordiaux > 120 71 14 jours ??

MECANISMES DE L’IOP Atrésie > 120 71 14 jours ?? Préovulatoire Antraux Préantraux Secondaires Primaires Atrésie Primordiaux > 120 71 14 jours ??

MECANISMES DE L’IOP > 120 71 14 jours ?? Préovulatoire Antraux Préantraux Secondaires Primaires Primordiaux > 120 71 14 jours ??

MECANISMES DE L’IOP Atrésie > 120 71 14 jours ?? Préovulatoire Antraux Préantraux Secondaires Primaires Atrésie Primordiaux > 120 71 14 jours ??

3 exemples à partir de modèles animaux Kit ligand connexine 37 Nobox

Diminution du pool de follicules primordiaux kit-ligand et son récepteur c-kit

Kit ligand (KL) et c-kit Sl Steel : mutation kit ligand W White spotting : mutation c-kit Anémie, anomalie de développement des mélanocytes Diminution du taux de cellules germinales Cell 1990; 63: 213

Kit ligand (KL) et c-kit Sl Steel : mutation kit ligand W White spotting : mutation c-kit KL agit après liaison à c-kit sur les cellules germinales primordiales pour stimuler leur mitose

KIT gene Gène humain chromosome 4q12 Mutation dans le cadre de piébaldisme IOP n=42 Pas de mutation Shibanuma BMC Women’s health 2002; 2: 8

Modèle des souris invalidées pour la connexine 37 = ovocytes arrêt entourés d’une seule couche de cellules de la granulosa Simon, Nature 1997; 385: 525 => ROLE DES FACTEURS OVOCYTAIRES DANS LA PROLIFERATION DES CELLULES DE LA GRANULOSA

Exemple d’un gène exclusivement ovocytaire : NOBOX Newborn Ovary Homeobox gene In silico, trancripts de l’ovaire de rat nouveau-né Rajkovic A, Science 2004; 305: 1157

Newborn Ovary Homeobox gene = souris invalidées Nobox Ovaires atrophiques Sans ovocytes Perte ovocytaire après la naissance, disparition à J14 Rajkovic A, Science 2004; 305: 1157

2 ème mécanisme des IOPs

MECANISMES DE L’IOP > 120 71 14 jours ?? Préovulatoire Antraux Préantraux Secondaires Primaires Primordiaux > 120 71 14 jours ??

Blocage de la maturation folliculaire GDF9 GDF9B ou BMP15 RFSH FOXL2

GDF9 Growth differenciation factor 9 membre de la famille du TGF exprimé dans l ’ovocyte

souris invalidées pour GDF9 : ovaires petits blocage de la maturation au stade de follicule primaire, une couche (3b) Dong Nature 1996; 383: 531 Elvin Mol Endocrinol 1999; 13 :1018

Elvin Mol Endocrinol 1999; 13 :1018

Elvin Mol Endo 1999 13 : 1018

GDF9 souris invalidées GDF9 : anomalie ovocytaire : croissance plus rapide de l ’ovocyte, augmentation de volume de 70% par rapport aux ovocytes contrôles Carabatsos Dev Biol 1998; 203 : 373

TT 5 jours 10 jours Vitt J Clin Endocrinol Metab 2000; 141: 3814 Small preantral Large preantral Vitt J Clin Endocrinol Metab 2000; 141: 3814

N=203 Menarche 9,5 Regular menstrual cycles 21 days Amenorrhea 33 FSH = 104 mUI/L Biopsy : absence of follicles EJE 2006, 154: 1-7

GDF9B GDF9B ou BMP15 brebis Inverdale : 177 sur 3 générations Galloway, Nat Genet 2000; 25 : 279-283 Shimasaki S Endocr Rev 2004; 25 : 72

GDF9B brebis Inverdale : 177 sur 3 générations Mutation ponctuelle Hétérozygotes : portée double ou triple Homozygotes : IOP Galloway, Nat Genet 2000; 25 : 279-283

développement pubertaire Ovaires en bandelette 2 sœurs avec une IOP Absence de développement pubertaire Ovaires en bandelette Di Pasquale Am J Hum Genet 2004; 75

Di Pasquale Am J Hum Genet 2004; 75 :

N= 203 POF patients SA Laissue P, EJE 2006, 154: 1-7

BMP15

Rôles de BMP15

Blocage de la maturation folliculaire GDF9 BMP15 RFSH FOXL2

Blocage de la maturation folliculaire Familles d’aménorrhée primaire Nord de la Finlande Effet fondateur Etudes de liaison : chromosome 2p Aittomaki K, Cell 1995; 82: 959

Doherty, J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 1151

Biopsie ovarienne des patientes avec RFSH muté Aittomäki K 1996 J Clin Endocrinol Metab 81: 3722

G Méduri J Clin Endocrinol Metab 2003; 88 : 3491

FSH dépendant FSH indépendant 14 jours ?? > 120 71 Préovulatoire Antraux FSH dépendant Préantraux Secondaires Atrésie Primaires Primordiaux FSH indépendant 14 jours ?? > 120 71

Blocage de la maturation folliculaire GDF9 BMP15 RFSH FOXL2

Syndrome de blépharophimose

Syndrome de blépharophimose Autosomique dominant Type I BPES : Anomalies oculaires et infertilité uniquement féminine avec résistance à la stimulation par les gonadotrophines ( Type II pas de trouble de la fertilité) Chromosome 3q22-23

BPES blepharophimosis ptosis epicanthus inversus telecanthus Small et al., Hum Mol Genet, 1996. blepharophimosis ptosis epicanthus inversus telecanthus

BALANCED TRANSLOCATION translocation patient t(3;4) (q23; p15.2) Fukushima et al., Am J Med Genet, 1991.

BPES AND FOXL2 Crisponi et al., Nature Genetics, 2001. identification of causal BPES gene FOXL2 by Crisponi et al. (2001) forkhead transcription factor family

FOXL2: MUTATIONAL HOTSPOTS nucleotide position ATG TGA 238 391 693 898 939 1368 2745 1 52 152 221 234 376 amino acid position current study Ramirez-Castro et al. 2002 Kosaki et al. 2002 13 % Yamada et al. 2001 De Baere et al. 2001 30 % Crisponi et al. 2001

GENOTYPE-PHENOTYPE CORRELATION predicted truncated proteins  BPES type I : POF De Baere et al., Hum Mol Genet, 2001. 486C>G 404delC 945-946insC 490-492delATC 887C>T 1149-1156dup8 290-291delCA 892C>T 672-694del23 568-569insT nucleotide change wild type F F1 S BPES type

Syndrome de blépharophimose Gène FOXL2 Facteur de transcription pouvant interagir avec les membres de la famille du TGF Crisponi L, Nature Genet 2001; 27 : 159

Expression ovarienne de FOXL2 chez la femme Follicule mature cellules folliculaires A 40 semaines de développement A l ’âge adulte  pendant le développement et à l’âge adulte  pas d’expression dans les cellules germinales   pas d ’expression détectée dans les testicules Cocquet et al., 2002

Generation of a Foxl2lacZ allele by homologous recombination.

Eyelid anomalies. (Uda et al) Defects are apparent in 13.5 dpc Foxl2-/- embryos (B) by histology with hematoxylineosin staining, correlated with overt eyelid hypoplasia and open eyes at 17.5 dpc (D) and birth (F) compared to wild-type animals (A, C, and E).

Histologie des ovaires des souris sauvages et Foxl2lacZ homozygous

Foxl2-/- activinbA AMH GDF-9 KitL Foxl2wt activinbA AMH GDF-9 KitL

Foxl2

S Pangas Hum Reprod Update online 2005

3 ème mécanisme des IOPs

Accélération de l’apoptose Galactosémie Anomalies du chromosome X Gènes de l’apoptose

Galactosémie Galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) Anomalies oculaires, rénales, hépatiques Risque d’IOP = 60% à 30 ans J Pediatr 2000; 137: 833

Accélération de l’apoptose Galactosémie Anomalies du chromosome X Gènes de l’apoptose

Histoire d ’une vie ... (b) (d) (c) (a) Ullrich O. Z Kinderhkl 1930 : Première publication du cas d’une fillette de 8 ans atteinte du syndrome d ’Ullrich-Turner (b) Diplôme de fin d ’Études Secondaires à 19 ans (d) 60 ans, hypoacousie, pas de THS, ostéoporose modérée, HVG, HTA, TSH= 9.2mU/l Caryotype…XO (c) Études supérieures de chimie Travaille comme chimiste, Pas de développement pubertaire, otites à répétition, Wiedemann HR et al. Am Med Genet 1991

Monosomie X : phénotype le plus sévère

Syndrome de Turner : phénotype Aspect du visage : visage triangulaire FP obliques en bas et en dehors Implantation basse des cheveux Thorax déformé Ecartement exagéré des mammelons Pterygium colli Malformations © (1/3 des cas) í coarctation de l ’ aorte Seins peu développés Malformations du squelette anomalies du poignet anomalies de la main anomalies du genou Main Naevi Dysgénésie ovarienne (atrophie des gonades tissu fibreux st é rilit habituelle ) Utérus hypoplasique Pilosité très réduite • Petite taille ++ ( 1,42 m) Malformations rénales (1/2 des cas) Anomalies ORL (troubles de l’audition) Développement intellectuel dans les limites de la normale

Turner 50% monosomie X (45X) 5-10% duplication du bras long de l’X= Isochromosome (46 X,i,q (Xq)) 10% délétion partielle du chromosome X 30% mosaïques 45 X/46XX ou 45X/46XY de degré variable

Turner Puberté spontanée : 5-30% des cas Fertilité de 5 à 10% ++ en présence de mosaïque En cas de monosomie : 8-10% puberté normale Grossesse exceptionnelle

Turner

56 enfants et adolescentes : 8-> 19,8 ans 26% des patientes : présence de follicules

Infertilité et syndrome de Turner Dans le syndrome de Turner : Anomalies d’appariement en méiose Atrésie des cellules germinales Haploinsuffisance des gènes qui échappent à l’inactivation car Nécessité de 2 chromosomes X fonctionnels Nécessité de gènes du chromosome X en double dose pour une fonction ovarienne normale

Translocations X;autosomes Anomalies de structure du chromosome X Délétions Translocations X;autosomes => Régions critiques pour l’Insuffisance Ovarienne Prématurée

Etude des délétions et des translocations IOP et chromosome X Etude des délétions et des translocations => Région POF1 en Xq26.2-q28 => Région POF2 en Xq13.3-q22 Fassnacht et al, Cur Med Chem, 2006

Microdélétions du chromosome X et IOP ? NON Portnoï et al, Hum Reprod, 2006

A D B C Whole X painting Whole X painting (green) chromosome 1 (red) (X;1) translocation MF Portnoï et al Hum Reprod 2006

Translocations associées à IOP : POF1 et POF2 mais délétions interstitielles associées à IOP, surtout POF2 46,X,t(X;1)(q13.3;q32) 46,X,del(X)(q21.2) 46,X,t(X;9)(q21.31;q21.2) 46,X,del(X)(q21.32) 46,X,del(X)(q22.3) Xq Aménorrhée primaire Aménorrhée à l’âge de 25 ans

Rizzolio et al Hum Reprod 2006

et mécanismes moléculaires dans l’ IOP Chromosome X et mécanismes moléculaires dans l’ IOP Majorité des points de cassure au niveau du chromosome X dans l’IOP concerne des régions sans gènes (Xq21) suggère des mécanismes différents de l’atteinte directe d’un gène effet de position sur les gènes autosomiques transloqués sur le chromosome X

IOP et gènes candidats sur le chromosome X Fassnacht et al, Cur Med Chem, 2006

FMR1 Xq27.3 Syndrome de l’X fragile Répétitions d’un trinucléotide CGG en 5’ du gène < 50 normal 50 – 199 prémutation > 200 mutation complète

FMR1 inactivated gene Mutation (>200) Abnormal méthylation and FMR1 gene inactivation FMR1 gene CGG triplets Normal<40 Intermediate- 41-59 triplets Premutation: 60-200 triplets

Augmentation des transcripts du gène Affinité augmentée des protéines Gène FMR1 20% des femmes avec une prémutation ont une IOP Sherman Am J Med Genet 2000; 97: 189 Une prémutation est présente chez 3% des cas sporadiques d’IOP Une prémutation est présente chez 13% des cas familiaux d’IOP Conway G Hum Reprod 1998; 13: 1184 Sullivan AK Hum Reprod 2005; 20: 402 Augmentation des transcripts du gène Affinité augmentée des protéines Allen Hum Genet 2004; 114: 439

Gène FMR1 Augmentation des transcripts du gène Affinité augmentée des protéines Allen Hum Genet 2004; 114: 439

Hagerman Am J Hum Genet 2004; 74: 805

Quels sont les gènes impliqués dans l’apoptose ovarienne ?

Caspases bax Récepteur TNFa / FAS mitochondrie Bcl2 Ca2++ APOPTOSE endonucléases PARP noyau

sauvages 100 Bax -/- 20 mois 15000 nombre de follicules J42 30 000 Nature genet 1999, 21: 200 primordiaux primaires

Bax / bcl2 Invalidation du gène bax Augmentation du nombre de follicules primordiaux Diminution de l ’apoptose des cellules de la granulosa Science 1995; 270: 96 Invalidation du gène bcl2 Diminution du nombre de follicules primordiaux Endocrinology 1995;136:3665

Bax / bcl2 Expression ciblée de bcl2 dans les ovocytes de souris : Inhibe l’atrésie folliculaire Prévient l’apoptose in vitro, induite par la chimiothérapie Mol Endocrinol 1999; 13: 841

Accélération de l’apoptose Phénomène impliqué dans la toxicité De la chimiothérapie De la radiothérapie Nature Medicine 2000; 6: 1109

GENES IMPLIQUES DANS L ’INSUFFISANCE OVARIENNE CHEZ LA SOURIS R LH, R progestérone FSH b, R FSH Cycline D2 , IGF1 R ER a , Follistatine Connexine 37 Bax, Bcl2 GDF-9 , GDF9B Foxl2 Atm, c-kit, Wnt Dazl1

(RLH) (FSH b) RFSH FMR1,FMR2 XPNPEP2 Galt1 AIRE Diaph2 BMP15 FOXL2 GENES IMPLIQUES DANS L ’INSUFFISANCE OVARIENNE PREMATUREE CHEZ LA FEMME (RLH) (FSH b) RFSH FMR1,FMR2 XPNPEP2 Galt1 AIRE Diaph2 BMP15 FOXL2 ATM, WnT4

Stratégies de découverte des gènes Gènes candidats : Modèles animaux souris, brebis, drosophile Analyse des points de cassure de translocations Analyse par liaison génétique

Families IOP - France Famille FR1DA Famille FR2BO * ADN disponible * 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 5 10 1 2 * 1 2 3 4 5 6 Cas IOP * ADN disponible

Genome scanning (Génopôle) 457 microsatellite markers every 10 cM 441 on autosomes + 16 markers on X chromosome

CONCLUSION 1

Autosomes FSHR FOXL2 GDF9 ATM AIRE NOBOX GALT EIF2B NSB1 DMC1 Parathyroid responsive B1 gene FIGLA Progesterone receptor membrane component-1 SF1 ADAMTS 19? Chromosome X triple X Monosomie X Mosaïque X/XX Délétions X Translocations X FMR1 BMP15

LES GENES DE LA MENOPAUSE Nouvelles cibles contraceptives Nouveaux traitements d ’infertilité

DEVANT UNE IOP Taille ? Autoimmunité ? Yeux ? Galactosémie ? Caryotype TSHus Prélèvement d’ADN TT hormonal substitutif Don d’ovocyte

ROLE de l’ ENVIRONNEMENT??

Mais… Nature 2004

? + ??? CIRCULATION OVAIRE PERIPHERIQUE (tissu cible) MOELLE (niche) ? Cellules Progénitrices (CPG) Cellules différenciées (ovocytes) Cellules souches Germinales (CSG) J Johnson Cell Cycle Nov 2005