May, 12th 2007 Pierre ABADIE – ENS of Cachan INRA Bordeaux-Aquitaine, UMR Santé Végétale

Oomycota family (brown algae) Biotrophic parasite, introduced in France in 1878

 Since 1996, massive use of the fungicide famoxadone  Consequence: resistant pathogen strains of Plasmopara viticola quickly emerged  Resistance to famoxadone is due to a punctual mutation (G143A) in the mitochondrial gene coding the cytochrome b  General goal: acquire data on spreading and maintainance of P. viticola resistant strains, in the optif of improving fungicides application management.  My training period goal: studying fitness of resistant and sensitive strains to famoxadone  -> Is there a cost of resistance?

 Fitness = succès reproductif, capacité à survivre et à se multiplier  Mesure d’un indice de fitness = produit de plusieurs paramètres expérimentaux

 Goal: following the evolution of sensitive/resistant strains proportions during 8 cycles 5 couples R/S 3 initial mixes - 20%R 80%S - 50%R 50%S - 80%R 20%S Cycle 0Cycle 1 5 couples R/S 3 mixes - ?%R ?%S Reinoculation on leaves (1 week) FUNGICIDE CRIBLE (1 week) Visual notation to estimate resistant and sensitive percentages QUANTITATIVE PCR To estimate resistant and sensitive percentages Cycle 8

INOCULATION ON LEAVES Inoculation of 24 drips of 15µL, adjusted to 40,000 sporangias/mL One week at 22°C Sporulation

THE FUNGICIDE CRIBLE Inoculation on leaves disks sprayed with famoxadone (100mg/mL) Visual notation

ENSEMBLE DU TEST DE COMPETITIVITE

PREMIERS RESULTATS

MESURES PAR PCR QUANTITATIVE  Objectif: déterminer le % de résistants et de sensibles dans les mélanges du test de compétitivité afin de réaliser un suivi au cours des semaines (= complément des mesures du crible fongicide)  Etat d’avancement: mise au point de la méthode en cours, en attente des premiers résultats…  Protocole:  Utilisation de la sonde fluorescente « Sybr-green »  Extraction d’ADN de suspensions de sporanges réalisées à partir des 4 feuilles contaminées pour chaque mélange  Utilisation d’un couple d’amorces non spécifique R/S et d’un couple d’amorce spécifique R ciblant la mutation G143A du gène mitochondrial bc1  30 cycles d’amplification

MESURES PAR PCR QUANTITATIVE (5’) 1021 TTATGCGTGATGTAAATAACGGTTGGTTAATTCGATATATACATGCGAATGGTGCATCTT 1081 TTTTTTTTATTGTTGTATATATACATATTTTTAGGGGTTTGTATTACGGATCTTATATTA 1141 CACCTAGAGAAGCTTTATGGTGTTCAGGGGTAATTATTTTTATTTTAATGATGGCGACTG 1201 CATTTATGGGTTATGTTTTGCCTTGGGGACAAATGAGTTTTTGGG G TGCAACAGTTATTA 1261 CAAATTTATTCTCGGCTATCCCATTAATTGGAAAAGAAGTTGTTGACTGGTTATGGGGTG 1321 GATTCGCCGTTGATAATCCAACATTAAATCGTTTTTTTAGTTTACATTTCACCTTTCCAT 1381 TTGTAATTGTAGGGGCTGTACTAATACATTTAATTTTATTACATGAGGTAGGTTCAAATA (3’) : SNP G143A conférant le phénoptype résistant : amorces non spécifiques amplifiant R et S : amorces spécifiques amplifiant uniquement les R G

PERSPECTIVES  Poursuivre le test de compétitivité jusqu’à 8 cycles  Réaliser les mesures par PCR-Q  Réaliser un modèle d’évolution des souches R et S en fonction des paramètres de fitness (utilisation du logiciel Stella)  Analyser les données afin de déterminer si oui ou non la résistance implique un coût pour le champignon en absence de fongicide