Présenté par NGUYEN Khac Minh Huy Le 10 juin 2008

Plan I/ Introduction II/ Matériel et méthode 1/ matériel 2/ méthode d’échange de contre ion 3/ préparation des échantillons 4/ techniques utilisées III/ Résultat et Discussion IV/ Conclusion

I/ INTRODUCTION Equipe de Maïté PATERNOSTRE: études des mécanismes et des interactions moléculaire non covalentes. Auto assemblage d’un octapeptide: lanréotide Lanréotide:

INTRODUCTION (suite) Lanréotide: analogue thérapeutique de somatostatine Utilisation dans le cadre de traitement de l’acromégalie Acormégalie: pathologie liée à la croissance anormale de l’hormone de croissance But de ce stage: caractérisation de l’influence de nature de contre ion sur l’assemblage

II/ Matériel et méthode 1/ matériel le lanréotide synthétisé par IPSEN Pharma l’eau dé ionisée pour la solution la forme acide des contre ions de Hofmeister: H 2 SO 4, CH 3 COOH, HCl, HNO 3 et HClO 4

II/ Matériel et méthode 2/ Méthode d’échange des contre ions  1 ère étape: 2 amines protonées à pH neutre pKa est autour de 10 à 11 Adition de NaOH à la solution pour que le pH soit supérieur à pKa

II/ Matériel et méthode (suite) 2/ Méthode d’échange des contre ions  1 ère étape (suite) Lanréotide: déprotoné, insoluble, précipite centrifuge et lavage pour enlever le surnageant  obtention de lanréotide pure à cette étape

II/ Matériel et méthode (suite) 2/ Méthode d’échange des contre ions  2 è étape: Suspension de précipité dans la solution d’acide du contre ion Milieu acide  reprotonement de lanréotide Fixation de contre ion pour compenser les charges  Obtention de lanréotide/contre ion

II/ Matériel et méthode (suite) 3/Préparation de l’échantillon Obtention de différents échantillons par la lyophilisation (environ 48h) Dilution de de lanréotide/contre ion avec différentes concentrations (5% et 10%) Mise en capillaire afin de faire la diffusion de rayon X

II/ Matériel et méthode (suite) 4/ Techniques utilisées  Diffusion de rayon X aux petites angles L’expérience est réalisée sur la ligne de lumière ID2 à ESRF (Grenoble)

II/ Matériel et méthode (suite)  Spectroscopie infrarouge de transformée à Fourier L’expérience se fait sur le spectrophotomètre de type Bruker IFS 66

III/ RESULTAT ET DISCUSSION 1/ Caractérisation de l’assemblage du lanréotide Spectroscopie vibrationnelle de lanréotide dans l’eau avec différente concentration

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Spectre d’absorption de l’acétate

%fréquence% aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 1% 1642,984,73random6, ,116,46 feuillet-β antiparallèle 1,231 2% 1640,7281,7random6, ,718,29 feuillet-β antiparallèle 1,471 3% ,92random3, ,1836,25boucle2, ,9911,37 feuillet-β antiparallèle1, ,388,45 4% 1638,1347,67random3, ,4228,51boucle2, ,4714,2 feuillet-β antiparallèle1, ,769,61 5% 1639,2646,17random3, ,1626boucle2, ,7218,92 feuillet-β antiparallèle2, ,328,89 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/eau

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/eau %fréquence% aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 6% 1637,543,65random3, ,7130,52boucle2, ,1417,27 feuillet-β antiparallèle2, ,778,55 7% 1639,3938,52random2, ,3625,25boucle2, ,325,81 feuillet-β antiparallèle2, ,3610,4 8% 1639,5638,67random2, ,3623,61boucle2, ,325,81 feuillet-β antiparallèle2, ,3610,4 9% 1639,3737,75random3, ,9521,63boucle1, ,2529,15 feuillet-β antiparallèle3, ,2311,45 10% 1639,2937,9random ,2727,96boucle2, ,4624,55 feuillet-β antiparallèle2, ,559,88

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat du spectroscopie infrarouge du lanréotide/eau La modification de spectre se fait à partir de 3%. Les liaisons hydrogène commencent à se former et se structurer afin de stabiliser l’assemblage. Pour les faible concentration (1% et 2%), les liaisons hydrogènes dans la conformation aléatoire sont majoritaires. Cela explique la solubilité de lanréotide dans l’eau à faible concentration. Ce sont des liaisons hydrogène avec la molécule d’eau.

III/ RESULTAT ET DISCUSSION 2/Caractérisation de l’assemblage des lanréotides/contre ions Spectre de 10% du lanréotide/H 2 SO 4

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition de spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/H 2 SO 4 (10%) fréquence%aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 1641,129,14random2, ,618,47Boucle1,471 ou ,143,8 feuillet β antiparallèle 4, ,18,5

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I des lanréotide/contre ions Lan/contre-ionfréquence%aireAttributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 5% lan/ac. Acétique 1637,556,1Random4,483 ou ,113,2Boucle1, feuillet β antiparallèle2,372 ou ,715,8 10%Lan/ac.acétique 1640,329,19Random3, ,620,17Boucle1, ,942 feuillet β antiparallèle3, ,98,5 5% Lan/H2SO4 1640,936,63Random2, ,919,41Boucle1,552 ou ,535,5 feuillet β antiparallèle3,513 ou ,38,41 10%Lan/H2SO4 1641,129,14Random2, ,618,47Boucle1,471 ou ,143,8 feuillet β antiparallèle4, ,18,5 5%Lan/HNO3 1641,428,45Random2, ,622,94Boucle1, ,139,99 feuillet β antiparallèle3, ,68,6 10%Lan/HNO3 1641,136,14Random2, ,118,2Boucle1,451 ou ,536,3 feuillet β antiparallèle3,643 ou ,29,3

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I des lanréotide/contre ions (suite) Lan/contre-ionfréquence%aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 5% lan/HCl 1640,732,22random2,572 ou ,325,07boucle ,634,42 feuillet β antiparallèle3,443 ou ,28,28 10%Lan/HCl 1641,129,19random2,332 ou ,620,17boucle1,621 ou ,942 feuillet β antiparallèle4, ,98,5 5%Lan/HClO4 1641,128,44random2, ,424,65boucle1, ,938,9 feuillet β antiparallèle3, ,27,96 10%Lan/HClO4 1641,134,07random2, ,520,58boucle1,641 ou ,437,23 feuillet β antiparallèle3,623 ou ,18,1

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat de la spectroscopie infrarouge des lanréotide/contre ion La nature du contre ion ne provoque pas le changement de l’empilement moléculaire du peptide Le nombre de carbonyle dans les conformations impliquées ne change pas par rapport au lanréotide commercialisé

III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat de la diffusion de RX des lanréotide/contre ion Différence de diamètre du tube en fonction du rayon ionique du contre ion Difficile à interpréter le résultat de contre ion SO 4 2- car il s’agit d’un contre ion divalent Contre-ionDiamètre du tube de lanréotide/contre-ion (nm) Cl - 20 NO ,5 ClO ,1 CH 3 COO - 24

IV/ CONCLUSION La nature de contre ion n’influence pas de l’empilement moléculaire du lanréotide. Les objets formés sont toujours nanotubes quelque soit la nature de contre ion. La nature des contre ions change le diamètre du tube. Pour l’avenir, les chercheurs continuent à échanger d’autres anions monovalents de rayon ionique différents pour valider ou invalider ces résultats.