Evidence for a functional RNA element in the hepatitis C virus core gene Laura K. McMullan, Arash Grakoui, Matthew J. Evans, Kathleen Mihalik, Montserrat Puig, Andrea D. Branch, Stephen M. Feinstone, and Charles M. Rice PNAS, February 2007

HCV - Long CDS codant une polyprotéine clivée ensuite pour donner les protéines virales - Présence d’une région hautement conservée ce qui est atypique vu la « fiabilité » de la polymérase virale - CDS alternative (ARF = Alternative Reading Frame) détectée dans cette région - ARF code pour 2 protéines – F et DF - Passage ORF → ARF par un de frame-shift ARF - Ac anti-ARF détectés chez des patients => ARF traduite - Protéine(s) ARF non indispensables à la réplication virale (mutations non-sens) - Apparition et sélection de révertants Matériel et Méthodes 1. In vivo - Mutagénèse - Infection de chimpanzés - Analyses de sérum et hépatocytes 2. In vitro - Séquençage - Cultures cellulaires (Huh 7 et Huh 7.5)

Mutagénèse - Introduction de 4 codons STOP Site frame-shift 1 Site frame-shift 2

Evolution de la charge virale après infection de chimpanzés avec le virus muté [HCV] et [ALT] moins élevées par rapport à des cinétiques obtenues avec des virus wt Virus maîtrisé au bout de semaines (atténuation probable due aux mutations) Souche moins virulente mais réponse cellulaire forte

Séquençages hebdomadaires des virus circulants Apparition et sélection de révertants dans les codons STOP 3 et 4 Restauration de la séquence wt de la protéine DF

Effets des mutations dans l’ARF sur des hépatocytes en culture Le virus muté se réplique moins bien Les réversions dans les codons STOP 3 et 4 restaurent la réplication aux niveaux du wt Ce sont les codons STOP 3 et 4 qui sont responsables de la baisse de la réplication

Etude du pouvoir infectieux et pathogène du virus chimérique H/JFH STOP 1,2,3,4 5’ NTRNS2NS3 3’ NTR H77 JFH Virus recombinant infectieux grâce à 2 mutations adaptatives virus chimérique H/JFH

Réplication du virus H/JFH STOP 1,2,3,4 pol- H/JFH H/JFH STOP 1,2,3,4 Détection de NS5A (brown) et des noyauw cellulaires (bleu) au jour Réplication initialement faible du virus H/JFH STOP 1,2,3,4 Réplication virale de plus en plus intense

Apparition progressive de révertants Coexistence transitoire des révertants et des mutants Disparition du mutant au bout de 3 semaines

Concluison Un mutant non-sens au niveau de l’ARF est moins virulent mais capable de générer une réponse immunitaire de type cellulaire normale qui finit par maîtriser rapidement l’infection Protéines prédites à partir de l’ARF non détectées Les protéines potentiellement codées par l’ARF ne sont pas indispensables à la réplication virale (absence possible de traduction) Emergence de révertants => pression de sélection Les réversions restaurent les appariements au niveau des tiges de la structure 3D de l’ARN viral => la structure 3D de l’ARN correspondant à l’ARF est importante pour le virus

Structure prédite de l’ARN transcrit à partir de l’ARF Rôle soupçonné dans la régulation de la réplication et de la transcription (interaction de l’ARF avec 5’NTR) Participation possible de l’ARN ARF dans des complexes d’ARN régulateurs plus grands