S. D. Raynaud Département d’Hématologie Biologique CHU de Nice DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New Tools: SNP arrays, mutations, Expression profiles S. D. Raynaud Département d’Hématologie Biologique CHU de Nice

Trois décennies de recherche en onco-hématologie Génomique transcriptomique Génétique Moléculaire Cytogénétique Protéomique / NGS / Génomique Fonctionnelle Bases moléculaires des hémopathies => Amélioration de la prise en charge des patients 1980 1990 2000 2010

Southern blot : délétions et amplifications Techniques classiques de détection des déséquilibres chromosomiques et géniques Délétion: caryotype Régions communes de délétion, double minutes, homogenous staining regions, caractérisation des gènes partenaires de translocations. Del 16q Normal Cytogénétique Délétions, amplifications, double minutes, caractérisation des partenaires d’une translocation. FISH Délétion p53 Délétion Southern blot : délétions et amplifications

Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des déséquilibres chromosomiques Résolution (Sensibilité en % cell anormales) Détection des UPD Nécessite Cellules en division Distinction entre clones individuels Caryotype sur métaphases Faible (10 à 15%) Non Oui FISH Faible (élevée) CGH arrays Elevée (20-30%) SNP arrays Très Elevée (20-30%) FISH: Fluorescent in situ Hybridization CGH: Comparative Genomic Hybridization SNP: Single Nucleotide Polymorphism UPD: Uniparental Disomy

Nouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPE Support solide (verre, plastique, métal, silicone) Chip = cible miniaturisée composée de clones ADNs (BAC, PAC, P1s, oligonucleotides) Taille des clones variable (oligomères à  200 kb Nombre de clones par array: < 300 à > 250 k Basée sur principe biochimique de l’hybridation complémentaire ADN/ADN ADNs test et référence sont marqués par fluorescence : Cy3 (tumeur) / Cy5 (référence) Hybridation compétitive des ADNs test et référence sur les séquences cibles

CGH sur microarray : LA TECHNIQUE ADN (0.1 g à 5 g) marqué par random priming avec incorporation de colorants fluorescents (Cy3 & Cy5) Dénaturation d’ADN Cot-1 et de l’ADN marqué Pré-hybridation ADNs marqués appliqués sur la lame Hybridation (conditions variables) Lavages Puces scannées, puis étapes de quantification du signal, normalisation, et exploitation des données grâce à des logiciels dédiés Plateformes spécifiques (four à hybridation, station de lavage, scanner, logiciels informatiques dédiés)

Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arrays Détection des gains et pertes de matériel génétique Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arrays Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300

Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14 Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14.2-3 D13S319 / D13S25 (Microarray 300 Abbott)

LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32

LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Délétions multiples / Ampli 9q11.2

Etude des LOH par analyse des Microsatellites Délétion: LOH marqueur microsatellite Paradigme de la progression tumorale: Mutation d’un allèle, perte de l’allèle normal et duplication de l’allèle anormal.

Analyse des cancers humains par SNP-CHIP Single nucleotide polymorphism (SNP) TGCAT GCATGCA : Allele A TGCAA GCATGCA : Allele B Sonde SNP Oligonucléotide CHIP ADN

Data analysis of SNP-CHIP Heterozygosity (A/B) Homozygosity (A/A) Allele specific Total gene dosage Allele specific gene dosage Total gene dosage Allele A Allele B Allele A Allele B Hybridized signal Matched Normal Matched Normal Hybridized signal Tumor Tumor Allele B is missing in Tumor Gene dosage reduction Gene dosage reduction

Principes de base des techniques de SNPs appliquées au caryotypage moléculaire (allelo-karyotyping) A gauche, technique utilisée par Affymetrix SNP-A; à droite, bead array plateforme utilisée par Illumina (San Diego, CA), incluant les variants 1 et 2 couleurs utilisés par les arrays Infinium I et II X (Illumina). Analyse bioinformatique: Mesure les pertes d’hétérozygotie par génotypage (fréquence des calls hétérozygotes) et détermination de l’intensité des signaux d’hybridation. Traitement des données via différents logiciels. Ex. CNAG qui combine l’analyse des CNV et des LOH Résultats à évaluer en tenant compte de la variabilité normale du génome: 12% du génome contient  1500 régions variables (CNV) type duplications et délétions taille moyenne de chaque CNV 20Mb Des centaines de gènes sont en CNV Détection des CNA et UPD Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112:965-974

Réduction du Dosage Génique Délétion homozygote 4 2 Dosage génique Héterozygotie Dosage génique spécifique d’allèle Barres roses : LOH détectées dans tumeurs 2 1 0 Délétion hétérozygote LOH Un allèle est absent, l’autre allèle est intact Chromosome 9

Dosage génique spécifique d’allèle Dosage génique normal 4 2 Dosage génique Hétérozygotie Dosage génique spécifique d’allèle 4 2 2 1 0 2 1 0 Un allèle délété (Vert) Un allèle amplifié (Rouge) : Uniparental disomie (UPD) LOH: Loss of Heterozygosity Chromosome 9 (UPD) Chromosome 10 (Normal)

Identification de UPD somatiques Entraînent LOH sans anomalie du dosage génique. Ce phénomène concerne des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Dispersés sur tout le génome. Conséquences potentielles en oncologie: duplication d’un gène muté, homozygotie d’un allèle de susceptibilité, duplication d’un gène avec profil de méthylation atypique, haploinsuffisance... Attention: Ne pas confondre avec faux LOH ou LOH reliquat d’une étape précoce de l’embryogénèse LOH détectés chez 8% à 10% individus contrôles Tous sont interstitiels et ont une taille moyenne de 8,7Mb (Maciejewski et al, Blood 2008) Toute lésion interstitielle <24.8Mb (95% CI) est exclue ou doit être confirmée par étude du tissu sain du patient (Maciejewski et al, Blood 2008).

Probablement somatique Confirmer sur CD3+ ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR L’IDENTIFICATION D’UNE ANOMALIE CHROMOSOMIQUE D’ORIGINE SOMATIQUE D’après Maciejewski, Patras 2009 Exclure une CNV par : la taille de l’anomalie sa localisation le % de recouvrement avec une CNV connue Confirmé par MC ou FISH Ne pas pousser plus loin l’investigation SNP-a Détection d’une lésion Micro délétion Microduplication télomérique Somatique UPD Interstitiel ≥ 25Mb Somatique Interroger CNV database Interstitiel ≤ 25Mb Probablement non somatique CNV connu Pas de CNV Germline Probablement somatique Confirmer sur CD3+

Place des SNP- et CGH-arrays dans l’analyse des SMD/AML Objectifs principaux : Démembrement des anomalies cryptiques Impact sur le pronostic (révision potentielle des scores pronostiques) Corrélation avec réponse aux nouvelles molécules thérapeutiques Quelques cibles des investigations pangénomiques : SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array-CGH SMD avec del(5q) SMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevé Formes frontières SMD/SMP

Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS, MDS/MPD, and MDS-derived AML. Gondek LP et al., Blood. 2008 Feb 1;111(3):1534-42. Cohorte de 175 patients Fig. 5 Type, frequency, and number of lesions detected by MC and SNP-A. (A) The frequency of chromosomal aberrations and noninformative results as detected by both MC and SNP-A. The insert in the SNP-A pie chart shows the portion of acquired UPD, either as the sole change or in addition to other abnormalities. (B) The percentage of patients with 0, 1, 2-3, and more than 3 lesions, respectively, as detected by MC (■) and SNP-A (□). Pie charts demonstrate distribution of low versus advanced stage of MDS within noninformative and normal karyotypes detected by MC and SNP-A.

Impact sur la survie du SNP-A caryotypage (Maciejewski, Patras 2009) 1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS Grouping by lesions Survival Low risk – No additional SNP lesions NR Low risk – with additional SNP lesions 157 months Advanced risk – No additional SNP lesions 21 months Advanced risk – with additional SNP lesions 9 months 2 - Survival outcome for new recurrent lesions Anomalies des Chromosomes 7, 11, 17 et 6, détectées par SNPs: valeurs de p très significatives (Log rank p=<0.0001)

UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357

UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes Région de UPD Gène Maladie UPD9q JAK2 MPD UPD13q FLT3-ITD AML UPD17q NF-1 JMML UPD17p TP53 sAML UPD21q RUNX1 UPD19q CEBPa UPD4q TET2 MDS, AML, MPD UPD1p C-MPL MDS/MPD, MPD UPD11p WT1 UPD11q C-CBL CMML, sAML Profil Génomique des LMMC : 43% UPD 4q24 (TET2) 37% UPD 11p (WT) 12% UPD 11q23.3 (CBL) 8% UPD 1p13.2 (NRAS) Ces régions de UPD sont aussi celles de mutations mono/bialléliques connues de nombreux gènes (JAK2, FLT3, c6MPL W515L, NRAS, p53, RUNX1…)

Grimwade, D. et al. Hematology 2009;2009:385-395 Frequency of prognostically relevant molecular and cytogenetic subgroups of AML arising in younger adults Grimwade, D. et al. Hematology 2009;2009:385-395 Copyright ©2009 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 1 Pie chart illustrating the molecular heterogeneity of cytogenetically normal AML based on mutations in the NPM1, CEBPA, MLL, FLT3 (ITD and TKD mutations at codons D835 and I836), NRAS, and WT1 genes Dohner, H. et al. Blood 2010;115:453-474 Copyright ©2010 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Next Generation Sequencing (NGS) Depuis 2005 de nouvelles méthodes de séquençage massif ayant en commun le clonage et l'amplification moléculaire ont été développées. Ces méthodes permettent d’amplifier spécifiquement un fragment d’ADN isolé soit dans des microgouttes d’huiles (GS-FLX, Roche) soit par fixation sur lame (Solexa). Les étapes de clonage bactérien particulièrement longues sont ainsi évitées. Trois méthodes utilisent actuellement ce nouveau système : le GS Flex basé sur l'amplification de l'ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et le pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate) le Solexa basé sur l'amplification, l’accrochage-liaison sur puce et l'utilisation de terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes, le SOLID basé sur l'amplification par émulsion et l'hybridation-ligature chimique. Ces méthodes offrent de nouvelles perspectives dans de nombreux domaines tels que la génomique médicale (impact majeur dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques). Ley et al., Nature, 2008 : Séquençage du génome entier d’un patient LAM (Illumina/Solexa) Cependant, ces avancées posent de nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultats.

IRON: The Interlaboratory RObustness of NGS Study Aims: To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep-sequencing analysis of hematological tumors To evaluate 454 technology in terms of interlaboratory precision and accuracy Testing of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratories Sample processing including MIDs using the MLL-designed Assay-on-demand plates (96-well) and Titanium Amplicon chemistry Establish a “454 Hematology Focus” group Publish consensus guidelines on QC and assay robustness

IRON Study: Participants and laboratories Prof. Haferlach, Münchner Leukämie Labor, München Dr. te Kronnie, Università degli studi di Padova, Padova Dr. Timmermann, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin Germany Italy Germany USA Dr. Simen, 454 Life Sciences, Branford Prof. Young, St. Bartholomews, London GB Prof. Vandenberghe, UZ Leuven, Belgium Belgium Austria Dr. Gabriel, Blood Bank, Linz Austria Italy Switzer-land Brazil Italy Prof. Martinelli, University of Bologna Spain Dr. Garicochea, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre Nether-lands Dr. JH Jansen, Radboud University Medical Centre, Nijmegen

Transcriptomique Classification morphologique des hémopathies (FAB, WHO, WF) Classification cytogénétique des hémopathies (LAL, LAM, LNH) Classification moléculaire des hémopathies (LAL, LAM, DLBCL)

Classification moléculaire des Lymphomes DLBCL de l’adulte puce cDNA Alizadeh et al., Nature 2000;403:503

Classification moléculaire des Lymphomes 274 DLBCL puce cDNA Wright et al., PNAS 2003;100:9991.

360 LAL pédiatriques puce Affymetrix - Clustering à partir des 40 top gènes identifiant chaque catégorie. Pas d’identification des ss-classes B. 20% des LAL restent inclassables. 70% des gènes identifiant les HD sont sur l’X ou le 21 (indépdt de +X ou non). 4 cas classés dans TEL-AML1, sans t(12;21) Tous anormaux pour TEL. Yeoh et al., Cancer Cell 2002;1:133.

Comparaison LAL / LAM

Nouvelles cibles thérapeutiques Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41.

COST:European COoperation in the field of Scientific and Technical research Kick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ans

Chair: K. Mills 17 pays européens Chair: L. Bullinger Chair: S. Raynaud Chair: S. Lehman Chair: RA Padua Chair: M. Dugas 17 pays européens