CONAKRY : Pr Aliou BALDE ANGERS : Pr Olivier DUVAL CONTEXTE Groupe CIDPHARMEF 2008/09 CONAKRY : Pr Aliou BALDE ANGERS : Pr Olivier DUVAL

« Thématiques structurées et spécialités scientifiques »  groupe « PROVASC »: Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine naturelle pour la protection vasculaire. coordonné par Pierre Pacaud (UMR 915, Inserm / Université de Nantes) BUT  Identifier les molécules et extraits d’origine végétale possédant des propriétés anti-oxydantes et anti-AGEs et valider leurs effets thérapeutiques sur certaines maladies

Moyens  laboratoires  « Thématiques structurées et spécialités scientifiques » Moyens  8 laboratoires sur la région Pays de Loire > 2 M € sur 4 ans laboratoires  * Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) Dir. D. Henrion * Substances d’Origine Naturelle et Analogues Structuraux (SONAS) Dir. P. Richomme

RESULTATS PRELIMINAIRES

Extraits hydroalcooliques de 4 plantes Guinéennes

 Test de la fonction vasculaire sur artères isolées Laboratoire de Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) UMR CNRS 6214 / INSERM 771  Dir. D. Henrion Membre du groupe « PROVASC »: Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine naturelle pour la protection vasculaire.  Test de la fonction vasculaire sur artères isolées

Myographe pour Artères de résistance Mulvany, M.J., Halpern, W., 1977. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation 41, 19-27.

Exemples des deux substances contrôles : 1- Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales : Exemples des deux substances contrôles : Tempol (SOD-mimétique) et apocynine (inhibiteur des NAD(P)H-oxydases). Tempol 10-4 M Apocynin 10-4 M W U46619 B A Wall force (mN)

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales : Les substances testées (50 µg/ml) diminuent l’action vasoconstrictrice du U46619. Une partie de cette effet résulte de la stimulation de l’endothélium. SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal % inhibition de la contraction Avec endothélium Sans endothélium

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales: Les 6 substances testées (50 µg/ml) induisent une vasorelaxation, en partie via la stimulation de l’endothélium. SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal % relaxation Avec endothélium Sans endothélium

Conclusion: Perspectives: Vasorelaxation en partie par un effet direct sur l’appareil contractile et en partie par stimulation de l’endothélium vasculaire. Perspectives: 1- Eclaircir le mécanisme d’interaction avec avec l’appareil contractile (effet anti-oxydant et/ou autre(s) mécanisme(s)) 2- Eclaircir le mécanisme de stimulation de l’endothélium et la voie impliquée (NO, EDHF, prostanoïdes…).

SONAS : UPRES EA 921, Dir. Pr P. Richomme Extractions et analyses chromatographiques : GC, CC, MPLC, CLHP-DAD & CLHP-DDL, FCPC (collaboration Kromaton Technologies) Analyses structurales : RMN 270, 300 & 500 MHz, Spectromètres de masse : Haute résolution (B/E), LC-MSn & maldi-tof

VEGEPOLYS LE CONTRAT DE PÔLE : UN LABEL ET UN ENGAGEMENT 5 axes thématiques validés par le et la Recherche Innovation Variétale Qualité Sanitaire des Semences et Plants Santé et Végétal Horticulture et Paysage Urbain Veille et l’Intelligence Economique

Valtech VEGEPOLYS : Les Centres Techniques CIET Plante et Cité Innovation Variétale Qualité sanitaire des semences et des plants Santé et Végétal Centre d’Innovation et de Transfert de Technologie du Végétal Spécialisé Valtech Veille et intelligence économique dans le végétal CIET Centre d’Intelligence Economique Territorial Horticulture et Paysage urbain Plante et Cité

Potentiel antioxydant Balance oxydative Potentiel antioxydant de l’organisme Radicaux libres et ROS endogènes (respiration, système immunitaire…) ou exogènes (UV, radiations ionisantes, métaux…) Stress Oxydatif Enzymatique (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase…) ou non (acide ascorbique, vitamine E, flavonoïdes, Polyphénols…)

 Tests AntiOxydant - AO Radicaux libres et ROS Tests d’activités Antioxydantes

Tests AO – ORAC (Total Oxygen Radical Absorbance Capacity) Principe : Sous l'action des radicaux libres introduits volontairement dans un milieu réactionnel, un substrat particulier* ainsi détruit perd sa capacité de fluorescence tandis que cette dernière persiste lorsqu’un (des) capteur(s) de radicaux libres est(sont) incorporé(s) dans le milieu. Objectifs : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un composé, d’un mélange… exprimée en équivalent Trolox** par g, par mL (TE/g, TE/mL) … *b-phycoerythrine, fluoresceine. (*acide hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique, analogue synthétique hydrosoluble de la vitamin E)

Oxydation de la fluorescéine en présence Tests AO - ORAC Oxydation de la fluorescéine en présence d’AAPH (Ou et al, 2001)

Tests AO - ORAC => valeur ORAC exprimée en équivalents TROLOX

Tests AO - DPPH Test DPPH Principe : Une solution méthanolique d’un radical stable, le DiPhénylPicrylHydrazyl présente une coloration violette (lmax 517 nm) qui disparaît avec la destruction du radical. Objectif : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un composé, d’un mélange… exprimée en équivalent Trolox ou comparée à celle de conservateurs utilisés dans l’industrie agro-alimentaire : BHA (butylhydroxyanisole), BHT (butylhydroxytoluène)…

Tests AO - DPPH Garcinia viellardii (Clusiaceae): A.-E. HAY, M.-C. AUMOND, S. MALLET, V. DUMONTET, M. LITAUDON, D. RONDEAU and P. RICHOMME : "Antioxidant xanthones from Garcinia viellardii", J. Nat. Prod., 67 (4), 707-09 (2004)

Test de Peroxydation des Lipides Tests AO - Peroxydation lipidique Test de Peroxydation des Lipides Principe:A partir d’un modèle « naturel » (microsomes hépatiques), dosage des peroxydes en présence ou non d’un(d’) agent(s) AO => dosage colorimétrique (532 nm) des TBARS/MDA après oxydation (Fe2+/Vc ou AAPH) Objectif : Evaluation du degré de protection des acides gras polyinsaturés vis à vis de la peroxydation.

Tests AO - Photochem® Principe : Génération photochimique de radicaux libres détectés par chemiluminescence. Objectif : évaluation automatisée du potentiel antioxydant de composés/mélanges hydro ou lipophiles. Mesure de l’activité de la superoxyde dismutase Inconvénient : Technique manuelle (10/j)

RESULTATS PRELIMINAIRES

Tests DPPH

Tests Anti-AGEs = D. SERAPHIN, S Tests Anti-AGEs = D. SERAPHIN, S. DERBRE Advanced Glycated Endproducts, inhibitors and breakers ● Formation des AGEs ou réaction non-enzymatique de Maillard - Complications des diabètes - Maladies neurologiques (Alzheimer…) - Maladies articulaires… ► Médicaments potentiels ► Actifs de produits cosmétiques ou de compléments alimentaires - Vieillissement tissulaire

Tests Anti-AGEs ● Obtention de la quantité maximale d’AGEs en un minimum de temps - Plaque 96 puits ; détection : fluorescence λexc 370 nm ; λem 440 nm - Nature et concentration de la protéine : BSA 10 mg/mL - Sucre réducteur : ribose 0,5 M - Conditions physiologiques : 37 °C / tampon phosphate 50 mM pH 7,4 - Durée de l’incubation : 24 h 1. J. A. Vinson et al., J. Nutr. Biochem. 1996, 7, 659-663.

Méthode de criblage des anti-AGEs ● Criblage de molécules pures - Molécule testée : gamme de concentration 10-5 à 10-2 M - Soustraction de la fluorescence intrinsèque de la molécule → détermination de la CI50

Test Anti-AGEs ● Criblage de molécules pures → test efficace

=> analyse complémentaire Test Anti-AGEs : application au SONAS ● CI50 12 => analyse complémentaire 16 inhibiteurs 52 inactifs 2 inducteurs 82 éch./SONAS

Callophyllum wallichianum Test Anti-AGEs ● Criblage d’extraits végétaux Derris ferruginea Callophyllum wallichianum Ecorces de tiges Tiges Feuilles → Problèmes de quenching

RESULTATS PERPECTIVES

RESULTATS  PERPECTIVES  Résultats encourageants pour les AOs + sur vaisseaux En attente de mise au point pour la méthode AGEs PERPECTIVES  Mise en place du projet (conventions avec Angers et autres) Convention entre pays membre Identification de la plante Échanges de chercheurs …

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales: Application sur une artère précontractée en présence ou en absence d’endothélium. Exemple de l’acétylcholine entièrement endothélium dépendante. ACh bulles ACh Bulles: le passage de quelques bulles d’air dans la lumière de l’artère enlève l’endothélium

1. J. Peyroux M. Sternberg, Pathologie Biologie. 2006, 54, 405-419.

Test anti-AGEs sur Extraits bruts Rinçage

Test anti-AGEs sur Extraits bruts - Développement et automatisation d’un criblage adapté aux extraits végétaux → immobilisation de l’albumine au fond des plaques 96 puits → rinçage des interférents possible Doctorat co-encadré PCDA/SONAS