Diagnostic des viroses décembre 2007 Virologie
Introduction Le diagnostic est avant tout clinique. Pourquoi (ou pour qui) aller plus loin en mettant en évidence le virus (direct) ou un stigmate du virus (indirect) ? : affirmer le rôle effectif d’un virus pour des patients immunodéprimés de façon à pouvoir traiter ou prévoir l’évolution de la maladie, détecter la présence effective du virus pour éviter la virose (prophylaxie pour : greffons, transfusions, rubéole pour les femmes enceintes, sida pour les sexuellement actifs…) surveiller une épidémie et préparer les futurs vaccins. décembre 2007 Virologie
Mise en évidence du virus décembre 2007 Virologie
1. Mettre en évidence le virus 1.1. Par microscopie électronique décembre 2007 Virologie
1.2. Par immunolatex, immunofluorescence, immunochromatographie ou immunoenzymologie décembre 2007 Virologie
a. Recherche RT-PCR Identification 1.3. Par des techniques de biologie moléculaire a. Recherche RT-PCR Identification Détection des Norwalk-like par RT-PCR Fabienne Loisy , Pierre Le Cann, Monique Pommepuy Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer - Direction de l'Environnement et de l'Aménagement Littoral Département Microbiologie et Phycotoxines, BP 21105, 44311 Nantes Cedex 3, France RNA extraits incluant le RNA viral recherché Captation des RNA viraux spécifiques par une sonde biotynilée, fixée sur une bille magnétique streptavidinylée Purification par lavage du RNA viral : l’aimant permet de récupérer spécifiquement la sonde. RT-PCR : Amplification d’un RNA en DNA par transcription inverse en cDNA suivi d’une amplification classique. Transcription inverse du RNA viral puis Amplification par RT-PCR avec les amorces, les enzymes RT MuL V et DNA polymérase. L’amorce est la sonde Détection des amplicons classique. décembre 2007 Virologie
b. PCR quantitative (dite en temps réel) Fonctionnement de la PCR en temps réel : La plupart des PCR quantitatives (temps réel) sont basées sur la mesure d’émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés. Plusieurs techniques existent : elles utilisent soit des molécules se liant à l'ADN, soit des sondes moléculaires spécifiques de la cible amplifiée. Un seul exemple est développé. (voir notamment le site http://www.adiagene.fr/recherche.php Pour compléments) décembre 2007 Virologie
Un exemple d’utilisation de sondes : La fluorescence est obtenue par l’utilisation d’une sonde marquée. Le but est de faire apparaître la fluorescence de manière proportionnelle à la quantité d'ADN cible présent. Deux marqueurs sont nécessaires : un marqueur R (reporter) émetteur de fluorescence et un marqueur Q (quencher) qui absorbe cette fluorescence lorsque R et Q sont proches. Lorsque Q et R sont séparés soit par hydrolyse de la sonde, soit lors de l’hybridation des amorces, soit lors de la synthèse du brin complémentaire, la fluorescence de R n’est plus absorbée. La mesure de la fluorescence est donc proportionnelle au nombre d'ADN produits par la PCR, lui même proportionnel au nombre d'ADN cibles présents au départ. L'utilisation de sondes spécifiques de l'ADN cible recherché permet d'obtenir une très grande sensibilité décembre 2007 Virologie
Les courbes obtenues ont cette allure : Intensité de fluorescence Cycles de PCR Exemple d’application médicale : dosage de HCV dans le sérum. décembre 2007 Virologie
1.4. Mise en évidence du virus par culture problèmes de SÉCURITÉ Technique : prélèvement : écouvillons en gélose Charbon, aspirations ou sécrétions dans du milieu de Hanks, selles Conserver à 4°C culture sur MRC5 ou Véro après décontamination microbienne. Addition possible d’anticorps connus pour étudier l’inhibition de la culture en parallèle à la culture. examen des cultures pour déterminer les effets cytopathologiques (cytopathiques). décembre 2007 Virologie
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2. Mise en évidence ou titrage d’anticorps décembre 2007 Virologie
2.1. introduction Intérêt : rapide économique dangers virologiques faibles Inconvénients : fenêtre de séronégativité nécessite parfois deux prélèvements successifs et un titrage décembre 2007 Virologie
2.2. techniques Techniques classiques : immunoenzymologie immunofluorescence fixation du complément, inhibition de l’hémagglutination… Techniques particulières : neutralisation de l’ECP du virus par le sérum du malade western blot décembre 2007 Virologie