Biologie moderne des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) C.Preudhomme Laboratoire d’Hématologie A U524 Inserm Lille

Introduction 40 % des LAM : Anomalies cytogénétiques Identification de gènes Pronostic Diagnostic et suivi Physiopathologie Modèle murin 60 % des LAM : Identification d’autres mécanismes Identification d’autres gènes (analogie de fonction ou nouvelles technologies) Ciblage thérapeutique moléculaire

2003 Impact pronostique des anomalies chromosomiques Consensus international Bon risque t(15;17) t(8;21) inv(16) Mauvais risque -5/5q- -7 3q t(9;22) t(6;9) complexe Intermédiaire caryo normal Résultats contradictoires 11q23 trisomie 8 autres trisomies autres a.structure Reste à définir sur grandes séries prospectives

Distribution des anomalies chromosomiques varie avec l ’âge (St Jude -Schoch) <2 ans enfants Adult <60 ans Adult >60 ans t(8;21) 0% 14% 8% 2% inv(16) 5% 6% 5% 3% t(15;17) 0% 8% 6% 3% 5,3% t(9;11) 18% 6% 2% autres 11q23 23% 3% 3% 0,8% 41% 9% Normal 10% 20% 40% 40% Complex - < 10% 15% 30%

MRC10 t(8;21) t(15;17) inv(16) normal anomalies isolées associées à risque intermédiaire associées à mauvais risque

Caryotype complexe Basé sur résultats caryotype (cytogénétique conventionnelle) Définition variable MRC >=5 anomalies EORTC/GIMENA >=4 anomalies Autres groupes >=3 anomalies Fréquence augmente avec âge enfant <10% adulte 8-10% >60 ans 18-30%

Que contient un caryotype complexe ? Schoch GCC 2002;35:20 Pertes >>>> gains -5/5q- -7/7q- 17p- 18q-, 12p- … moins fréquents souvent combinées (24% : les 3 délétions) 15%-20% des cas : absence d’anomalie 5/ 7/ 17

MRC Impact pronostique du caryotype complexe MRC10 15-56 ans MRC11 s.âgés

German AML cooperative group retrouve le mauvais pronostic >=3 anomalies chez <60 ans et > 60 ans Schoch BJH 2001; 112: 118

Les 11q23/MLL Distinction t(9;11)(p21;q23) et les autres 11q23/MLL LAM enfant Distinction t(9;11)(p21;q23) et les autres 11q23/MLL St Jude JCO 2002; 20: 2302

Les 11q23/MLL LAM adulte MRC CALGB SWOG BGMT95 MRC10 1998: tous 11q23/MLL dans groupe intermédiaire ASH2002: tous 11q23/MLL restent dans groupe intermédiaire CALGB t(9;11) dans groupe intermédiaire autres 11q23 dans groupe mauvais pronostic SWOG tous les 11q en mauvais pronostic BGMT95 11q23/MLL autres que t(9;11) mauvais pronostic

Les 11q23/MLL Seul screening FISH systématique recommandé (arbre décisionnel LAM) FISH double couleur cellules interphasiques=southern (sauf ITD MLL) cellules métaphasiques: identification partenaire Répertorier tous les partenaires MLL Déterminer le pronostic de chaque translocation

AML1 SCL

tractus gastro-intestinal Les Core binding Factor : 3 sous unités  et une seule  Gènes Fonction principale AML1 RUNX1/CBFA2/PEBP2aB Hématopoïèse AML2 RUNX3/CBFA3/PEBP2aC ossification AML3 RUNX2/CBFA1/PEBP2aA Développement tractus gastro-intestinal  1 domaine en commun : le domaine RUNT

Le domaine Runt CBF Forte homologie avec le gène « Wing » « Tail » CBF ADN Runt A’-B Forte homologie avec le gène runt de la drosophile 128 AA très conservés domaine Ig-like, semblable à p53, NF-B, STATs Fixation à l’ADN et association avec CBF Reconnaissance d’un motif PyGPyGGTPy R80 R174 R177

Fonctions de AML1 Rôle pivot dans l’hématopoïèse : souris KO aml1 -/- non viables Contrôle l’expression de nombreux gènes :  IL3, récepteur M-CSF, myéloperoxydase (MPO)…  chaînes ,, et  du TCR (T Cell Receptor)  inhibiteur de kinase cycline-dépendante p21WAF1 Fonction: Régulation de la croissance et de la différenciation des granulocytes

+ - MPO IL3 GM-CSF M-CSF R TCR EAR2 TAD 453 P21 WAF et autres... RHD  Effet activateur + MPO IL3 GM-CSF M-CSF R TCR Acetylation CREB Ac P300 / CBP ALY P-CAF LEF-1 RUNX1 Ac CEBP PU.1 c-MYB Ac RHD CBF  Effet inhibiteur mSin3A Fixation répresseur TLE - EAR2 TAD 453 P21 WAF et autres... RHD NLS VWRPY NM Liaison à la matrice nucléaire co-localisation avec la RNA pol 351 381

Différents partenaires Altération par translocations Différents partenaires  Core Binding Factor (CBF) fréquemment réarrangé dans les leucémies * t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO (MTG8) LAM t(12;21)(p12;q22) TEL-AML1 (AML1-ETV6) LAL t(16;21)(q24;q22) AML1-MTG16 LAM t(8;21)(q24;q22) AML1-ETO2 (TRPS1) LAM t(3;21)(q26;q22) AML1-EVI1, AML1-MDS1, AML1-EAP LMC, SMD t(19;21)(q13;q22) AML1-AMP19 LAM * inv16(p13;q22) CBFb -MYH11 LAM

Conséquences fonctionnelles Altération par translocations Conséquences fonctionnelles N-CoR Déacétylation, répression MTGR1 ETO2 MTG16 ETO HDAC ETO Bcl2 M-CSF R mSin3A AML1 RHD b GM-CSF TCR TGF CEBP

T(8,21) et INV(16) Cytogénétique FISH ou RQPCR si echec de caryo t(8;21) et M1/M2/M4 idem+normal si inv(16)

Mutations constitutionnelles de aml1  Familial Platelet Disorder (FPD)  prédisposition LAM  altération = délétion, mutations faux-sens ou non-sens  haploinsuffisance : Song et al. Nat.Genet. 2000

Mutations acquises et hémopathies malignes (1)  ~6,5% dans les HM (> 900 patients)  20-25% dans les LAM0 (34/142) Osato et al. Blood 1999 Yeoh et al. ASH 2000 Preudhomme et al. Blood 2000 Langabaer et al. GCC2002  35% dans les HM associées à Tri 21 acquises  30-40% dans les SMD secondaires (radiothérapie, chimiothérapie)

C/EBPa (1) La protéine C/EBPa Facteur de transcription indispensable à la différenciation myéloïde. Fixation sur les régions promotrices du G-CSF R, GM-CSF R, MPO,...

C/EBPa (2) Protéine C/EBPa Coopération avec d ’autres facteurs  AML1, CBF, PU-1...

C/EBPa (4) Protéine C/EBPa 2 domaines de transactivation 1 domaine ZIP : Liaison au DNA Dimérisation 2 ATG d ’initiation  Protéines de 42 ou de 30kD. bZIP TAD1 TAD2 30 Kd 42 Kd Effet dominant négatif de la 30kD.

LAM et mutations de CEBPA (3) Pabst et al, Nature Genetics, vol 27, March 2001 7 % mutations (10/137) dans les LAM. 16% (5/30) dans les LAM2 sans t(8/21). Gombart et al, Blood, vol 99, February 2002 408 échantillons de tumeurs toutes confondues. 11 patients mutés: 8/78 LAM 1/92 SMD (1 AREB-T) 1/36 cancer pulmonaire à petites cellules. 1/33 cancer de la prostate

Descriptif des Mutations de CEBPA 70 97 127 200 278 358 TAD1 TAD2 bZIP Wild type 1er groupe: Mutants N-Ter 159 Patients 1, 8, 11 Patients 2, 9  Patient 3 107 Patients 4, 6, 12 42kD tronquée  30kD Dominant négatif Patient 5 Patient 10 59 Patient 7 TAD2 bZIP Forme de 30kD: Patients 1 à 12

Descriptif des Mutations de CEBPA 70 97 127 200 278 358 TAD1 TAD2 bZIP Wild type 2ème groupe: Mutants C-Ter Patient 7, 9, 10, 11, 14, 15  Fixation au DNA ou dimérisation altérée 383 Patient 15 Patient 8 70 97 127 200 278 358 3ème groupe: partie centrale TAD1 TAD2 bZIP Wild type  313 Patient 12, 13 Domaine bZIP amputé

C/EBPa : survie globale CEBP Muté CEBP WT C/EBPa muté = amélioration de la survie globale P=0.03

C/EBPa A dominant-negative mutant of C/EBP, associated with acute myeloid leukemias, inhibits differentiation of myeloid and erythroid progenitors of man but not mouse Maike Schwieger, Jürgen Löhler, Meike Fischer, Uwe Herwig, Daniel G. Tenen and Carol Stocking Blood, 1 April 2004, Vol. 103, No. 7, pp. 2744-2752. C/EBPp30, a myeloid leukemia oncoprotein, limits G-CSF receptor expression but not terminal granulopoiesis via site-selective inhibition of C/EBP DNA binding Rebecca Cleaves, Qian-fei Wang and Alan D Friedman1 Blood. 2004 Apr 1;103(7):2744-52. Epub 2003 Dec 04.

 MRD+ chez les patients en longue RC Altération par translocations AML1-ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (1)  MRD+ chez les patients en longue RC  Miyamoto et al. PNAS 2000 HSC: cellules souches; CLP: progéniteurs lymphoides

Expression dans le compartiment myéloide Altération par translocations AML1-ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (2)  AML1-ETO Knock/In  absence d’hématopoièse fœtale hépatique  mort des souris (Downing, Zhang, August, 2001, vol98,n°18)  Souris transgèniques AML1-ETO avec promoteur myeloide-spécifique Expression dans le compartiment myéloide hématopoièse normale AML1-ETO seul ne suffit pas Si traitement ENU (mutation dans l ’ADN) LA

AML Class II Mutations Class I Mutations AML1/ETO, PML/RARa, BCR/ABL, FLT3-ITD Class II Mutations AML1/ETO, PML/RARa, C/EBPa lossof function Therapy : eg, imatinib mesylate, FTL3 inhibitors Therapy : eg, ATRA AML

Blocage de differenciation + prolifération FLT3 C-Kit RAS

835/836

FLT3 review (Kottaridis et al, BJH 2003)(3) n % Thiede et al 979 20.4 - hyperleucocytose - M3V Schnittger et al 1003 23.5 - M5  -  M2 Kattaridis et al 854 27 - caryotype normal -11q23 <0.5% - t(6,9) - Rare CBF  Pas d’influence sur la RC,  des rechutes

RAS 3 gènes : N, K, H RAS Mutations codons 12, 13, 61, autres LAM : N>K>H RAS 10 à 15% de mutations (25% dans les CBF) Valeur pronostique contreversée

Bilan : selon le caryotype

Groupes pronostiques (1) Selon le caryotype (MRC) favorable intermédiaire défavorable OS P=0.30 (NS)

Groupes pronostiques (3) Conclusion : Nouvelle classification proposée : Groupe 1 Groupe 3 Groupe 2 OS P=0.006 groupe 1 : MRC1, CEBP+, FLT3- groupe 2 : MRC2, RAS- et gpe 1 FLT3+, groupe 3 : MRC 3, RAS+

C-Kit Récepteur Stem Cell Factor Mutation ponctuelle dans mastocystose (codon 816) LAM : 1,5% mutation mais  inv(16) : 10-25% délétion exon 8 ; 5% D816  t(8;21) : 5% délétion exon 8 ; 5% D816 Associé à un risque de rechute augmenté

 Survie et rechute des LAM avec mutation de c-Kit exon 8 D’après Care et al. , Br J Haematol, juin 2003

Mutations All t(8;21) inv(16) N=81 N=58 N=33 Age (y) 33 [.8-60] 30.5 [4-58] 34 [.8-60] NS Sex Ratio (M/F) 44/37 29/19 5/18 NS WBC (G/L) 21 [1.7-257] 13.4 [1.7-155] 58.6 [4-257] p=.0001 Mutations KIT 15% (11/74) 11% (5/42) 19% (6/32) NS Ex8 11% (8/74) 7% (3/42) 16% (5/32) NS D816 4% (3/74) 4% (2/49) 3% (1/32) NS FLT3-D835 6% (5/81) 4% (2/48) 9% (3/33) NS RAS 21% (15/71) 11% (4/38) 33% (11/33) p=.02 N-RAS 16% (12/73) 8% (3/40) 27% (9/33) p=.03 K-RAS 6% (4/71) 3% (1/38) 9% (3/33) NS

CBF RTK- RTK- EFS OS RTK+ RTK+ Years Years P=.0007 P=.004 1 1 ,8 ,8 ,6 ,4 ,4 RTK+ RTK+ ,2 ,2 P=.0007 P=.004 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 Years Years

t(8;21) inv(16) RTK- RTK- OS OS RTK+ RTK+ Years Years P=.06 P=.0007 1 ,8 ,8 RTK- ,6 ,6 OS OS RTK+ ,4 RTK+ ,4 ,2 ,2 P=.0007 P=.06 2 4 Years 6 8 10 2 4 6 8 10 Years

Multivariate analysis (OS) RR P value RTK Mutation 3.50[1.56-6.85] .002 CBF (t(8;21) vs inv16) 3.03[1.01-8.39] .04 Age* 1.005[.998-1.012] NS WBC* 1.005[.982-1.030] NS *continuous variables

BAALC (Brain And Acute leukemia cytoplasmic) - Localisé en 8q22.3 - Corrélation entre +8 et hyperexpression de BAALC - Baldus et al, Blood 2003 80 caryotypes normaux < 60 ans CAL GB 9621 - Résultats pas de différence age, sexe, flt3, NP, Hb mais BAALC faible : ­ leuco et M5 pas influence sur RC ­ BAALC ¯ survie : 1.7 VS 5.8 years ¯ EFS : 0.8 VS 4.9 years ¯ DFS 1.4 VS 7.3 years

- Facteur pronostic indépendant D’après Baldus et al, Blood 2003

EVI 1 EVI 1 : lié à caryotype défavorable lien avec 11q23 - Localisé en 3q26 - Anomalies rares mais de mauvais pronostic - t(3;3) ou inv(3) [ hyperexpression EVI 1 et/ou EVI 1-MDS1 - Groupe Hollandais, Blood 2003 319 patients RQ-PCR : EVI 1 + MDS1 - 6 patients Groupe I EVI 1 + MDS1 + 26 patients Groupe II EVI 1 - MDS1 + 12 patients Groupe III EVI 1 - MDS1 - 275 patients Groupe IV EVI 1 : lié à caryotype défavorable lien avec 11q23 groupe I et II : pronostic très défavorable

Ÿ Courbes de survie

p = 0,01 p = 0,008

P.Lepelley - Laboratoire d ’Hématologie - CHU de LILLE ETUDE DU PHENOTYPE MDR P.Lepelley - Laboratoire d ’Hématologie - CHU de LILLE 22 oct 2003

PHENOTYPE MDR Expression cellulaire de protéines de transport Efflux et/ou redistribution intracellulaire Résistance croisée - Glycoprotéine-P (MDR1) - MRP (multidrug resistance associated protein) - LRP (lung resistance protein) - BCRP (breast cancer resistance protein) Modulation par agents pharmacologiques

Expression de PgP,MRP,LRP,BCRP Intérêt pronostic de la PgP Etudes discordantes : problèmes méthodologiques

TEST FONCTIONNEL D ’EFFLUX DE LA RHODAMINE 123 Rh123 (200ng/ml) 45mn 20°C Marqueur mitochondrial (523nm) 2 temps: Accumulation (A) Efflux (E) +/- Vérapamil(V) Spécifique de la Pgp MRP: efflux+/- > 4h non inhibé par Vp Efflux 2H 37°C + Vérapamil (10g/ml)

Phénotype MDR / PgP dans les LAM et SMD (247pts) Age moyen: 56 ans, 96 pts<55 ans - 151 pts >55 ans 20 cas (9 neg) étudiés au diag et en rechute/acutisation pas de conversion Corrélation avec l ’age (p<0.001) et avec CD34 (p < 0.001)

FACTEURS PRONOSTIQUES DES LA préthérapeutique LAM Age Leucocytose Cytogénétique “FAB” + DMP 2ème VS de novo LAL Age Leucocytose Cytogénétique Phénotype + mutations : FLT3 RAS CEBPA P53 c.Kit Autres chimiosensibilité Délai de RC Chimio sensibilité Maladie résiduelle Délai de RC Maladie résiduelle

LA MALADIE RESIDUELLE Clinique Cytologie PCR Chimiothérapie Nombre de blastes 1011 1010 1012 Clinique Cytologie Rémission complète 10-2 PCR 10-5 Temps Chimiothérapie

INTERETS DU SUIVI DE LA MALADIE RESIDUELLE PAR RQ-PCR DANS LES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES PRESENTANT UNE TRANSLOCATION t(8;21)

MATERIEL ET METHODES I. PATIENTS Age médian : 46 ans 21 patients homogènes 235 prélèvements sanguins et médullaires 29 patients suivis au CHRU de Lille (1994 - 2003) 2 allogreffes 27 échantillons concomitants de moelle et de sang 5 LAM1 20 LAM2 1 LAM4 3 inconnus 2 interruptions thérapeutiques précoces

RESULTATS I. ANALYSE GLOBALE Ø Patients 100% de rémission complète en post-induction 10 patients rechutent (10 à 37 mois après le diagnostic) Survie globale moyenne : 101 mois Survie moyenne sans rechute : 70 mois Ø Résultats de RQ-PCR 8 échantillons exploitables par patients. 28,5 mois de médiane de suivi Valeur médiane du taux de transcrit au diagnostic : 9.10-1 (0,23 à 31,3) Valeur médiane du taux de transcrit à la rechute : 4,86.10-1 (2,3.10-3 à 24,6)

III. COURBES DE MR DES 21 PATIENTS HOMOGENES RESULTATS III. COURBES DE MR DES 21 PATIENTS HOMOGENES Ø Catégorisation des patients 3 groupes identifiés en fonction de l’évolution des courbes de suivi : P Groupe A : 8 patients Ê MR < 10-5 en post-induction c Groupe A : 1 seule rechute

Ê MR < 10-5 dans les 6 premiers mois RESULTATS P Groupe B : 7 patients Ê MR < 10-5 dans les 6 premiers mois c Groupe B : 0 rechute

Ê Pas de MR < 10-5 dans les 6 premiers mois RESULTATS P Groupe C : 6 patients Ê Pas de MR < 10-5 dans les 6 premiers mois c Groupe C : 5 rechutes

Temps avant rechute / Catégories RESULTATS Ø Facteurs pronostiques identifiés Catégories établies en fonction de la MR à 6 mois Temps avant rechute / Catégories p = 0,00001 1 / 15 * 5 / 6 * * : nbre de rechute : patients du groupe A + B - - - : patients du groupe C c différence très significative c absence de passage de MR sous 10-5 dans les 6 mois = facteur de mauvais pronostic

PFS / valeur MR post-induction RESULTATS Catégories établies en fonction de la MR post-induction PFS / valeur MR post-induction (seuil = 10-3) p = 0,006 5 / 8 * * : nbre de rechute 1 / 10 * p = 0,01 PFS / perte 3 log de MR après l’induction : patients perdant + de 3log de MR après l’induction ---- : patients perdant - de 3log de MR après l’induction 4 / 6 * * : nbre de rechute 2 / 12 * : patients dont la MR post-induction est < 10-3 ---- : patients dont la MR post-induction est > 10-3 MR > 10-3 en post-induction Chute < 3 log en post-induction c différence très significative = facteur de mauvais pronostic

V. COMPARAISON MR MOELLE ET SANG RESULTATS V. COMPARAISON MR MOELLE ET SANG 27 prélèvements concomitants de moelle et de sang P Différence MRmoelle - MRsang : entre -1,27 et +1,37 ; moyenne à -0,13 y = 2,0894x 1,0539 R 2 = 0,9526 1,E-07 1,E-06 1,E-05 1,E-04 1,E-03 1,E-02 1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 MR Moelle MR Sang c Coefficient de détermination à 95% = MRmoelle et MRsang comparables

Scnittger et al, BLOOD, 2003

Krauter et al , JCO 2004

Others transcripts Very few data * MLL AF9 * multiple splice site : difficult * scholl et al : GCC, November 2003 8 patients + 2 cell lines Feasibility of RQ PCR : OK But sensitivity : LOW * less than 20 samples analyzed  No clinical relevance demonstrated

Involved in pathogenesis of wilms tumor WT1 Tumor suppressor gene located on chromosome 11p13 Involved in pathogenesis of wilms tumor High expression in ovary, testis, spleen Expression observed in more than 80% of AML Expression low in PB but variable in BM Qualitative RT PCR : few interest for MRD RQ PCR : more interesting in PB than in BM

Cillioni et al, Leukemia,2002

835/836

Kottaridis

Maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes: approche cytométrique L. Campos P. Flandrin Laboratoire d ’Hématologie Hôpital Nord - CHU de St. Etienne

Phénotypes associés à la leucémie Expression croisée d’antigènes: marqueurs lymphoïdes sur cellules myéloïdes (ou inverse). Expression asynchrone d’antigènes: coexpression d’antigènes de maturité et d ’immaturité d’une même lignée. Surexpression antigénique: augmentation d ’expression d ’un antigène sur une cellule. Cellules exprimant des propriétés aberrantes en taille et structure.

Orfao et San Miguel (Blood 2001): 126 LAM en rémission complète, après la chimiothérapie d ’induction, >10-2 : élevé 10-3-10-2 : intermédiaire 10-3-10-4 : faible < 10-4 : très faible

Survie sans rechute à 3 ans:

Venditti ( 2002): 56 patients, après chimiothérapie d ’induction et de consolidation, résultats: après induction: taux cellules avec phénotype aberrant = 4.5 x 10-4. (seuil) > 4.5 x 10-4 : 53 % de rechute < 4.5 x 10-4 : 40 % de rechute .

après consolidation: taux = 3.5 x 10-4. > 3.5 x10-4 : 77 % de rechute. < 3.5 x10-4 : 17 % de rechute.  L ’étude de la maladie résiduelle après consolidation semble + prédictive du risque de rechute.

Probabilité de survie en fonction de MDR après consolidation (Venditti, 2000)

Laboratoire d’Hématologie A Calmette U524 Inserm Cosson N. Grardel J.P. Kerckaert P. Lepelley H. Leroy C. Roche C. Roumier V. Soenen Techniciens Cliniciens MDS CHRU Lille F. Bauters S. De Botton B. Quesnel « P. Fenaux » Laboratoire de Génétique Médicale CHRU Lille J. Andrieux J.L. Laï Membres du Groupe ALFA Membres du GBMHM « Intergroupe LAM »