Invalidation du gène Tph1 chez la souris Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007

La découverte de la sérotonine Erspamer & Vialli, 1937 Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des muscles lisses: elle est nommée entéramine. Rapport et coll., 1948 Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux: elle est appelée sérotonine. Erspamer & Asero, 1952 Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance. Twarog & Page, 1954 La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est présente dans le cerveau des mammifères.

La sérotonine: fonctions biologiques Système nerveux central thermorégulation nociception mémoire et apprentissage cycle veille/sommeil comportement sexuel/maternel prise alimentaire humeur contractilité cardiaque tonus vasculaire Système cardiovasculaire Système sanguin fonction des lymphocytes hémostase Développement embryonnaire différenciation neuronale synaptogenèse division cellulaire morphogène développement cardiaque Système gastro-intestinal péristaltisme

La sérotonine: pathologies associées Système nerveux central schizophrénie douleur anxiété dépression comportements suicidaires agressivité migraine alcoolisme hypertension artérielle systémique et pulmonaire cardiopathie hypertrophique cardiopathie dilatée Système cardiovasculaire Système sanguin asthme thrombose Système gastro-intestinal tumeurs carcinoïdes syndrome du colon irritable Développement embryonnaire retard de croissance

Les acteurs du système 5-HT 1/ des récepteurs spécifiques 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes. Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à l’exception du récepteur 5-HT3. Expression dépendante de l’organe et de l’espèce considérés. 5-HT Na+ Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaques chez la souris. R.à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT3) Na+ Signalisation intracellulaire

Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes d’inactivation Un mécanisme de recapture: Le transporteur de haute affinité SERT 5-HT R. Recapture Ext. Int. Na+ R. à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT3) Na+ Signalisation intracellulaire

Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes d’inactivation Un mécanisme de dégradation: La monoamine oxydase MAO 5-HIAA MAO VMAT Na+ R. à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT3) SERT 5-HT R. Signalisation intracellulaire Recapture

Tryptophane hydroxylase Les acteurs du système 5-HT 3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT noyaux du raphé tryptophane Tryptophane hydroxylase neurones myentériques cellules entérochromaffines 5-hydroxytryptophane 5-HTP Décarboxylase des aa aromatiques Mélatonine glande pinéale 5-hydroxytryptamine SÉROTONINE

Inactivation du gène Tph chez la souris Stratégie de « knock-in » locus Tph endogène locus Tph muté Vecteur de ciblage Les souris Tph-/-(+/-) sont viables ♂ Tph1+/- x ♀ Tph1+/-

Deux gènes Tph… 2 gènes Tph Tph2 Effondrement du taux de 5-HT. glande pinéale *** neurones myentériques cellules entérochromaffines Effondrement du taux de 5-HT. 2 gènes Tph noyaux du raphé Taux de 5-HT normal. Tph2

Lieux d’expression des gènes Tph 65% d’identité TPH2 4 5 6 7 8 9 10 11 TPH1 Domaine catalytique 83% d’identité Domaine de régulation et d’interaction 1 2 3 Région 3’ non traduite Souris invalidées pour le gène Tph1 Biosynthèse de 5-HT TPH1 non neuronale Glande pinéale Cellules entérochromaffines 90% 5% TPH2 neuronale Neurones 5-HT du raphé Neurones myentériques

Temps d’expression des gènes Tph 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5 Naissance glande pinéale Tph1 E14.5 SNC Tph2 E10.5 Tph2 E12.5 NM intestins Tph1 CE E15.5 Sérotonine de l’embryon

En résumé … parents adultes 15% 3% 50% Tph1+/- 3-15% Tph1-/-(+/-) Souris viables 100% de survie *** 3% 15% *** adultes Tph1-/-(+/-) 3-15%

Conséquences du faible taux de 5-HT circulante? Tph1-/-(+/-) 3-15% Conséquences du faible taux de 5-HT circulante? Problèmes cardiaques Faible taux de 5-HT circulante dysfonctionnement?

La cathéterisation de conductance Courbe de fonction ventriculaire gauche = contractilité Insuffisance cardiaque Pression Volume Pression éjection contraction relaxation remplissage Volume

Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1-/-(+/-) 3-15% Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1+/+ Tph1-/- Phase de compensation Souris 273 Phase de décompensation Tph1-/- Souris 296

Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1-/-(+/-) 3-15% Le phénotype cardiaque est hétérogène n=30 n=7 n=30 n=7

Hétérogénéité importante Conclusion (1) parents 50% Tph1+/- Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Souris viables 100% de survie adultes Tph1-/-(+/-) 3-15% Hétérogénéité importante

Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque? Tph1-/-(+/-) 3-15% Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque? Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque?

Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie? Tph1-/-(+/-) 3-15% Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie? Protocoles envisageables: Exercice physique (marche forcée, nage). Une stimulation adrénergique. Protocole expérimental choisi: Test pharmacologique d’effort avec la dobutamine. Inotrope + ( force de contraction) Bathmotrope + ( conduction) Chronotrope + ( fréquence) dobutamine Catécholamine de synthèse Agoniste 1-adrénergique

Aucune réserve contractile cardiaque… Tph1-/-(+/-) 3-15% Aucune réserve contractile cardiaque… Souris Tph1-/- Non sensibles Souris Tph1-/- sensibles Survie (min) Souris Tph1-/-(+/-) non sensibles sensibles Souris contrôles Survie moyenne des souris Tph1-/-(+/-) après dobutamine: 11.4 ± 2.8 min.

Modification de la signalisation 5-HT cardiaque Tph1-/-(+/-) 3-15% Modification de la signalisation 5-HT cardiaque Étude de liaison des récepteurs -adrénergiques cardiaques Tph1+/+ Tph1-/- Kd (nmol/l) 0.03 ± 0.00 0.045 ± 0.02 Bmax (fmol/mg prot.) 39.66 ± 2.24 42.42 ± 3.08 β1/β 2 (%) 51 ± 49 52 ± 48 Ø modification de la signalisation -AR. Étude de liaison des récepteurs 5-HT cardiaques x 2 néoexpression Tph1+/+ Tph1-/- 5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51 5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211 SERT (fmol/mg prot.) 13 57

Hétérogénéité importante Conclusion (2) parents 50% Tph1+/- Absence de réserve contractile cardiaque Souris viables 100% de survie stress, facteur aggravant de la cardiopathie adultes Tph1-/-(+/-) 3-15% 5-HT2B SERT Hétérogénéité importante Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque

Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie? Tph1-/-(+/-) 3-15% Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie? Protocole expérimental: Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. Détermination des taux individuels de sérotonine circulante. Contrainte: Analyser un nombre important d’animaux . Analyse des souris Tph1-/- issues de mères Tph1-/-. Générer un nombre important d’animaux mutés dans une même portée Diminuer l’hétérogénéité entre les individus d’une même portée.

Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! parents 50% Tph1+/- Tph1-/-(+/-) 3-15% Souris viables Très peu de naissance 100% de survie adultes Tph1-/-(+/-) 3-15% 5-HT2B Tph1-/-(-/-) SERT 20% de survie Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie

Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle? Tph1-/-(-/-) Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements Génotype des embryons % d’embryons petits / malformés +/+ +/- -/- 3 28 - 3.6 1 4 6 2 27 3.7 11 24 10 6.7 80 9 88.9 15 86.7 Embryons normaux malformations létales à ~E12 Tph1+/+(+/+) Tph1-/-(-/-) Tph1+/+(+/-) Tph1+/-(-/-) La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal.

Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! ?? parents 50% Tph1+/- Tph1-/-(+/-) 3-15% Souris viables Très peu de naissance 100% de survie adultes Tph1-/-(+/-) 3-15% ?? 5-HT2B Tph1-/-(-/-) SERT 20% de survie Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie

Quel phénotype cardiaque? Tph1-/-(-/-) ?? Quel phénotype cardiaque? Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques. Tph1+/+ Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) 2 mois 5 mois PPVGd (cm) 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.06 ± 0.01 Ұ PPVGs (cm) 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.07 ± 0.01 *** Ұ Ұ Ұ Sd (cm) Ss (cm) 0.08 ± 0.01 * Ұ Ұ DIVGd (cm) 0.41 ± 0.01 0.42 ± 0.01 0.41 ± 0.04 0.43 ± 0.05 0.48 ± 0.05 ** Ұ DIVGs (cm) 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.03 0.25 ± 0.05 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.05 ** Ұ Longueur VG (cm) 0.82 ± 0.03 0.80 ± 0.06 0.77 ± 0.07 0.86 ± 0.07 0.84 ± 0.05 Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois. Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). Se développe entre 2 et 5 mois.

Quel phénotype cardiaque? Tph1-/-(-/-) ?? Quel phénotype cardiaque? Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles. 5 mois FS (%) FC (bpm) 2 mois Signes fonctionnels de CMD:  FS (index de contractilité)

Quel phénotype cardiaque? Influence du génotype maternel Tph1-/-(-/-) ?? Quel phénotype cardiaque? Mesure des marqueurs plasmatiques précoces d’insuffisance cardiaque. BNP (pg/ml) Augmentation plus importante chez les Tph1-/-(-/-). 5 mois CK-MB (µg/l) Troponine Ic (ng/ml) Augmentation des marqueurs précoces d’IC chez les Tph1-/-(+/-) Les souris Tph1-/-(+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé Influence du génotype maternel

Augmentation +++ des marqueurs d’IC Augmentation ± des marqueurs d’IC Conclusion (3) parents 50% Tph1+/- Tph1-/-(+/-) 3-15% Souris viables Très peu de naissance 100% de survie 20% de survie adultes Tph1-/-(+/-) 3-15% ?? 5-HT2B Tph1-/-(-/-) SERT Cardiopathie dilatée Augmentation +++ des marqueurs d’IC Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC

La sérotonine circulante 90% de la sérotonine circulante est synthétisée dans les cellules entérochromaffines par la TPH1. Neurones myentériques (TPH2)  99% plaquettes sanguines Cellules entérochromaffines (TPH1) 5-HT  1% plasma

Taux de sérotonine plaquettaire? Tph1-/-(-/-) ?? > 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines. 5-HT sang total (µM) Même taux de 5-HT entre les souris Tph1-/-(+/-) et Tph1-/-(-/-). 5 mois Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire.

Taux de sérotonine plasmatique? Tph1-/-(-/-) ?? < 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin. 5-HT plasma (nM) Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre les Tph1-/-(+/-) et -/-(-/-). 5 mois

Corrélation 5-HT / cardiopathie? Tph1-/-(-/-) ?? 5-HT plasma BNP corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin.

Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique Conclusion (4) parents 50% Tph1+/- Tph1-/-(+/-) 3-15% Souris viables Très peu de naissance 100% de survie 20% de survie 3-15% 41% 3-15% 20% adultes 5-HT2B Tph1-/-(-/-) corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. Tph1-/-(+/-) SERT Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC Cardiopathie dilatée Augmentation +++ des marqueurs d’IC Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique

Le génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? Tph2 Tph1 E10.5 E14.5 E15.5 E12.5 5-HT2B SERT 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.5 Naissance Sérotonine maternelle Sérotonine de l’embryon

La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique? Tph1-/-(-/-) diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1-/-(-/-)? augmentation du catabolisme de la 5-HT? Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1-/-. modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes?

Les plaquettes sanguines 20% Les plaquettes sanguines Tph1-/-(-/-) Nombre de plaquettes sanguines. 5 mois Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel . Plaquettes (103/µl) La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines

… une première piste? Plaquettes sanguines Sérotonine 5-HT2B SERT 5-HT2A? 5-HT2B? SERT 5-HT2A SERT Réarrangement du cytosquelette Réarrangement du cytosquelette 5-HT mégacaryocytes proplaquettes plaquettes

L’implication des petites protéines G? cardiomyocytes adultes Maintien du phénotype 5-HT foetal 5-HT2B x 2 SERT x 5 Réarrangement anormal du cytosquelette Formation anormale du cytosquelette  activation petites protéines G (RhoA?)  contractilité cardiomyocytes  maturation Mégacaryocytes / proplaquettes 5-HT . 5-HT 5-HT2B SERT mégacaryocytes

sérotonine maternelle Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite… Études épidémiologiques Environnement maternel