Étude de la qualité des ovocytes de la perche commune : utilisation de critères morphométriques et de nouvelles approches protéomiques Castets Marie-Dorothée Encadrants: Pascal Fontaine, Jean-Noël Gardeur, Bérénice Schaerlinger

Modification des performances de reproduction Domestication de nouvelles espèces Approche générique Maîtrise du cycle de vie Géniteurs Perca fluviatilis Ovocytes Spermatozoïdes Larves Œufs Modification des performances de reproduction Besoin d’indicateurs de qualité – morphométriques/moléculaires 1

1. Protocole expérimental Collecte d’ovocytes Ovocytes fécondés Incubation (laboratoire) Suivi : mesure des caractéristiques Base de données œufs/paramètres Classification des œufs / qualité (ACP-CAH) Site expérimental de La Bouzule Ovocytes non fécondés Congélation Mise au point du protocole F. Silvestre, Namur Analyse protéomique Protéines d’intérêt ? 2

2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes Géniteurs poids, date de ponte Ovocytes diamètre et poids ovocytaire, fragmentation des pontes Œufs fécondés Taux de fécondation à 3 jours, Durée d’incubation, Durée d’éclosion, Taux d’éclosion Larves Taux de malformation larvaire, Taille des larves à l’éclosion, Taux de survie à 7 jours, Taux de résistance au jeûne OD jc l 3

2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes Résultats : Analyse en Composantes Principales – Cercle des corrélations 0.8 0.4 -0.4 - 0.8 Axis 1 Female weight Egg weight Fragmentation rate Oocyte diameter Fertilization rate Hatching rate Incubation duration Hatching duration Malformation rate Larval size at hatching Survival rate after 7 days -0.8 Axis 2 Spawning date Axe 1 Taux de survie larvaire à 7 jours Taux de résistance au jeûne Axe 2 Taux de fécondation Taux d’éclosion Starvation tolerance Axe 3 Taux de malformation larvaire Variables non impliquées dans des axes Variables actives Variables illustratives 4

2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes Résultats : ACP + CAH – Classification des pontes 2.25 0.75 -0.75 -1.50 15-3 1.50 15-2 15-1 28-1 34-1 37-2 34-3 36-2 34-2 36-1 36-3 39-1 39-2 37-3 35-3 35-2 35-1 28-3 22-3 22-1 6-3 21-2 16-3 16-2 21-3 16-1 27-1 28-2 37-1 21-1 22-2 6-1 6-2 42-2 42-3 25-1 25-2 27-3 27-2 42-1 Mr Hr Fer Lz Sm s7d Ew Hd Sf Od Frr Id Sw Classe A Classe B -3 -2 -1 1 2 Axis 1 Axis 2 5

5 à 6 pontes de chaque classe sélectionnée pour une étude protéomique 2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes Résultats : Caractéristiques des classes Mise en évidence de 2 catégories de pontes selon l’ACP    Classe A Bonne qualité Classe B Qualité moyenne Taux de survie à 7jours (%) 93 39 Taux de résistance au jeûne (dl50; jour) 12 6 Taille des larves à l'éclosion (mm) 5 Taux de malformation larvaire (%) 1 4 Ajout d’1 catégorie de pontes sans aucune fécondation Classe C Non Fécondées 5 à 6 pontes de chaque classe sélectionnée pour une étude protéomique 6

3. Etude protéomique des ovocytes Technologie 2D-DIGE : Principe Std. interne 27.5µg Electrophorèse 2D Ech. 1 Ech. 2 Std. interne Ech. 1 Ech. 2 25µg 25µg Std. interne 27.5µg Ech. 3 Ech. 4 Std. interne Ech. 3 Ech. 4 25µg 25µg 7

3. Etude protéomique des ovocytes Résultats : spots d’intérêt (variation d’abondance intergroupe – p<0.05) 367 701 715 482 1029 1032 707 1469 1463 1406 1334 1681 1717 1660 1742 1683 1792 1610 1472 1953 1969 2399 2325 2474 2454 2708 2782 2835 2875 2252 2137 2447 20 30 50 40 60 70 80 90 Mr (kDal) 4 7 pI (pH units) 5 6 34 spots dont l’expression varie selon les groupes de pontes 8

3. Etude protéomique des ovocytes Résultats : Classification spots/oocytes 1 2 1-1 BQ MQ NF 1-2 1660 1717 2474 2454 1742 A B C D 2325 1792 2270 2708 2782 2835 2875 2137 367 2399 707 482 1681 701 715 1406 1610 1683 1441 1463 1029 1469 1472 1953 2447 1032 1334 1969 2252 -0.2 0.2 34 36 28 37 39 41 35 40 20 33 26 6 22 21 25 38 Groupe C Groupe A Groupe D Groupe B Qualité Moyenne Non Fécondés Bonne Qualité + 4 groupes : QM NF BQ Qualité Moyenne Non Fécondés Bonne Qualité 9

3. Etude protéomique des ovocytes Résultats : Identification des spots par spectrométrie de masse MS/MS - 19 spots identifiés / 34 Groupe A Groupe D Groupe B Groupe C QM NF BQ Inhibition de l’expression Activation de l’expression - Classification des fonctions biologiques 10

Biomarqueurs potentiels de qualité 3. Etude protéomique des ovocytes Perspectives : Protéines/fonctions potentiellement intéressantes Protéines du Stress Groupe B Protéines chaperonnes + protection des protéines lors d’un stress Ovocytes Non Fécondés Protéines du Stress oxydatif Groupe A Protection cellulaire contre les espèces réactives de l’oxygène Ovocytes Qualité Moyenne Biomarqueurs potentiels de qualité 11

Merci de votre attention. Remerciements : Equipes de l’Université de Notre Dame de la Paix (Namur) : Frédéric Silvestre, Patric Kestemont, URBO Edouard Delaive, Marc Dieu, URBC Equipe de l’UR.AFPA : -Yannick Ledoré, Alain Iuretig, Awatef Trabelsi, Kevin Debes Merci de votre attention. 12