Détection optique de biomolécules uniques Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

Mesure de l’activité enzymatique

Mesure optique de l’activité d’une cholestérol oxydase réduit (compatible avec une réaction en deux étapes) Lu et al., Science (1998)

Résolution/Localisation

Résolution spatiale vs Localisation localisation spatiale : déterminée par la précision de pointé du centre de la PSF (réponse impulsionnelle du système optique)

Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

PSF expérimentale Taille pixel : 216 nm Yildiz et al., taille du pixel: 86 nm Taille pixel : 216 nm

Réponse impulsionnelle Une molécule unique peut être considérée comme une source ponctuelle pour le système optique. La réponse impulsionnelle (la PSF, point spread function) est une fonction d’Airy, souvent approximée par une courbe gaussienne 2D. Rayon d’Airy (premier zéro) : Fonction d’Airy Gaussienne Gaussienne 2D : où NA = 1.45, l = 600 nm

Localisation La précision du pointé dépend de la capacité à déterminer la position du pic De manière générale, la précision s dépend de : nombre de photons collecté N taille a des pixels niveau de bruit b Dans le cas d’un signal dominé par le bruit de photons:

Explication qualitative On imagine que le point d’arrivée Xi de chaque photon peut être localisé sur le détecteur avec une précision infinie (pixel infiniment petit). On collecte N photons dont la distribution des positions (Xi) correspond à la PSF (de position moyenne m et de largeur s). On a un estimateur de la position moyenne.

Mouvement d’un moteur moléculaire : la myosin V Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization: A. Yildiz et al., Science 300, 2061-2065 (2003 ).

Déplacement de la myosin CY3 Déplacement de la myosin

Mouvement de la kinésine Yildiz, Science (2004)

Peut-on gagner en résolution ? si il existe un moyen de distinguer les deux objets : spectre d’émission, durée de vie, polarisation,… Lacoste, PNAS (2000) Si deux fluorophores identiques: photobleaching Gordon et al., PNAS (2004)

PhotoActivated Localization Microscopy (PALM) Photoactivation of a few PA-GFP tagged molecules with a blue laser at 405 nm Detection, localization (with nm resolution) and photobleaching with a laser at 488 nm

Current limitations: long aquisition time (hours) no z resolution

Les « motility assays » myosine/actine kinésine/microtubules Protéines/ADN

Interactions ADN-Protéines: visualisation optique en molécules uniques Mesurer des interactions qui ne se traduisent pas par un changement de longueur de l’ADN Ex: mécanisme de reconnaissance des sites d’activité (polymérase, endonuclease,…) Etudier des propriétés qui dépendent de la séquence

Location of target sites by DNA-binding proteins: a long-standing biological question Site-specific proteins must locate short targets on long DNA molecules. The location can be much faster than predicted by 3D diffusion. Ex: Lac repressor (Riggs 1970): experiments  kA>1010 M.s-1 (kA~108 M.s-1 expected) Proposed mechanisms involve interactions with non-target DNA: sliding : correlated motion along DNA hopping : small jumps between non-adjacent sites jumping : jumps between distant DNA sites

Stretching DNA Transverse fluctuations Wide field: stretched DNA of a DNA molecule Exposure time: 20 ms. Wide field: stretched DNA molecules Exposure time: 200 ms. A. Crut et al.,Phys. Rev. E 67, 051910 (2003)

Experimental results Interaction between EcoRV and DNA: (a) T7 DNA/SybrGreen (b) Qdot-EcoRV qdot 605 nm Exposure time: 20 ms Analysis of the trajectories: (a) (b) 2D Gaussian fit: center of the PSF (10-20 nm) Transverse motion: DNA thermal fluctuations Longitudinal motion: DNA fluctuations + diffusion ?

Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant Dt

Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant 2Dt

Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant 3Dt

Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen

Analysis of the transverse motion Trajectory : DNA thermal fluctuations + motion of the enzyme To extract the 1D-diffusion : Mean Square Displacement Transverse motion : <(x(t+)-x(t))2> = 2sx2 (1-e-  / f )  2 sx2 (Desbiolles et al., unpublished)

Analysis of the longitudinal motion Longitudinal motion: <(y(t+)-y(t))2> = 2 sy2 + 2D  Diffusion coefficient : D  2 10-3 mm2.s-1  (200 bp)2.s-1 (24 events) (qdot-EcoRV D3  10 mm2.s-1 )

Mesure en polarisation : étude de la dynamique rotationnelle de F1-ATPase

L’émission d’un dipole linéaire est polarisée Permet de réperer l’orientation du fluorophore Récemment : développement de colorant bifonctionnel

Relation entre changement de conformation et fonction: approche par transfert d’énergie

Transfert d’énergie ~ 1 ps laser distance R molécule donneuse acceptrice

Couplage dipole-dipole Si r << l, seulement le champ proche: Terme de couplage:

Transfert d’énergie Taux de transfert kT : R0 : rayon de Forster, en général de l’ordre de 5 nm tD: durée de vie de l’état excité du donneur en absence d’accepteur Efficacité du transfert : Mesure de distance à l’échelle: 0.5 R0 à 1.5 R0, soit entre 2.5 à 7.5 nm (comparable à la taille d’une protéine)

Rayon de Forster

Comment mesurer E ? mesure des intensités émises par le donneur et l’accepteur : mesure de la durée de vie du donneur : en l’absence d’accepteur en présence d’accepteur

Un vernier spectroscopique Deniz et al. PNAS (1999)

Etude de conformation de biomolécules Relier la dynamique des changements conformationels à la fonction: Ex: nuclease

Applications à l’étude du repliement des protéines Paradoxe de Lévinthal: on considère une chaine peptidique de 100 a.a. et on fait l’hypothèse qu’il y a trois conformations possibles par a.a. et que chaque conformation est explorée pendant 10-14 s Trep~ 1026 années !! Idée: Il existe des états intermédiaires qui sont de durées de vie brèves et sont difficilement accessibles par des mesures d’ensemble.

cold-shock protein from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima Bon système à deux états Schuler et al., Nature (2002) Mesure à l’équilibre : permet néanmoins de mettre une borne sur la barrière de potentiel.

Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique La temps de mélange tm est déterminé par la diffusion transverse wf2/D dans le canal. L’évolution temporelle se lit selon la distance dans le canal. 10 µm L tm ~ 10 µs T = L/v Si v est très grand : pas le temps de faire des mesures sur molécules uniques Knight et al., PRL (1998)

Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique (2) Lipman et al., Science (2003)

Visualisation de molécules uniques en cellules vivantes

Cells as interaction networks a complex network of biochemical interactions: Kholodenko, Nat. Rev. Mol. Cell. Bio (2006) organized in time and in space Single molecule imaging

compartimentalisation membranaire

The fluid-mosaic model Singer and Nicolson (1972) « fast » proteins diffuse with D ~ 0.1 µm²/s (movie from A. Kusumi’s lab)

Des molécules uniques comme des sondes de la membrane à l’échelle nanométrique

Tracking membrane proteins for d < 1 µm, diffusion is not affected by the probe with diffusion in a 2D medium

Deux problèmes avec le modèle de mosaïque fluide 1. Diffusion dans la membrane plasmique est plus lente que dans une membrane modèle d’un facteur 5 à 50 diffusion d’un lipide dans une membrane modèle: D ~ 1 µm²/s diffusion d’un lipide dans la membrane plasmique: D ~ 0.1 µm²/s 2. Lors d’une oligomérization, la diffusion est considérablement ralentie

Modèle d’organisation en microdomaine Murase et al. Biophys. J. (2004)

« Fence » and « Picket » Kusumi et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2005)

Morone et al. JCB (2006)

Dynamique de récepteurs aux neurotransmetteurs et plasticité synaptique

Transmission synaptique

Le récepteur de la Glycine Cl - Canal ionique pour le chlore (inhibiteur) Glycine Composé de 5 sous-unités sous-unité a sous-unité b Interaction de la géphyrine avec les sous-unités b Gephyrine

Lateral dynamics of Glycine receptors Change in the number of receptors at synapses during synaptic plasticity and synaptogenesis

Single quantum dot tracking of proteins in live neurons Acquisition time: 75 ms Total time : 65 s Red : marker for synapses Dahan et al., Science (2003)

Single QD tracking directly reveals entry and exit of receptors at synapses In red : marker for presynaptic vesicles (FM 4-64)

Dynamic equilibrium in the neuronal membrane: diffusion properties

Dynamic equilibrium in the neuronal membrane: kinetic parameters kout kin

Plasticité synaptique : modulation du potentiel d’interaction ?

Visualisation de l’expression génique

Visualisation de la synthèse protéique chez E Visualisation de la synthèse protéique chez E. Coli à la molécule unique Protéine membranaire taggée GFP Yu et al. Science (2006)

Fluctuations stochastiques Les protéines sont exprimées en « burst »: 4.2 protéines/burst, 1.2 burst/cycle La distribution du nombre de protéines suit une loi géométrique : rn(1-r) où r est la probabilité de traduction par le ribosome et (1-r) celle de dégradation du mRNA par les ribonucléases

Mouvement de moteurs moléculaires

Kinesin motors Kinesines are linear molecular motors with a crucial role in intracellular transport and cell division A lot of information from single molecule in vitro assays Stall force Fs  6 pN Steps = 8 nm Processivity = 1 m

Tracking individual kinesins in vivo Movie duration : 70 s accelerated 6x 5 µm cultured Hela cells The loading of QD-tagged kinesins is based on the osmotic lysis of pinocytic vesicles (Okada and Rechsteiner (1982)).

Velocity and processivity in vivo <velocity> = (0.57  0.02) m.s-1 <processivity> =(1.73  0.06) s In vitro <velocity> = (0.60  0.01) m.s-1 <processivity> = (1.73  0.09) s

Diffusive motion of kinesins unbound from MTs D ~ 5 10-3 µm²/s F necessary to carry a QD is ~ 0.6 pN, well below the stall force 6 pN

Des niveaux hiérarchiques d’information

De la molécule unique à la biologie « systémique »   « Systems biology is an emergent field that aims at system-level understanding of biological systems. What does it mean to understand at "system level"? Unlike molecular biology which focus on molecules, such as sequence of nucleotide acids and proteins, systems biology focus on systems that are composed of molecular components. Although systems are composed of matters, the essence of system lies in dynamics and it cannot be described merely by enumerating components of the system. »

From single molecules to systems biology Conclusion From single molecules to systems biology Describe quantitatively the spatio-temporal dynamics of molecular networks by accounting for: Diffusion (« Arguably, the most important defining characteristic of protein-based networks is that they are governed by diffusive processes » D. Bray, Nature 1995) Stochastic nature of biochemical equilibria

Conclusion A-t-on toujours un lien simple entre mesure d’ensemble et mesure en molécules uniques ? (théorie ergodique) inhomogénéités dépend de l’observable fluctuations temporelles : que se passe t-il s’il n’y a pas de valeur moyenne ?

1/t1.2 CCW T (s) « In this system, the time average of single-cell behaviour differs from population behaviour for timescales ranging from few to 103 seconds. » « The temporal fluctuations are a selected property of the network »