Sources de variabilité génétique dans la réponse à la warfarine Camille Hertzka, Ingrid Elbilia, Bénédicte Lamotte

« A polymorphism in the VKORC1 gene is associated with an interindividual variability in the dose- anticoagulant effect of warfarin » Giovanna D’Andrea, Rose Lucia D’Ambrosio, Pasquale di Perna, Massimiliano Chette, Rosa Santacroce, Vincenzo Brancaccio, Elvira Grandone, and Maurizio Margaglione. Publié dans « Blood », en janvier 2005 Camille Hertzka, Ingrid Elbilia, Bénédicte Lamotte

Camille Hertzka, Ingrid Elbilia, Bénédicte Lamotte Introduction Matériel, méthodes et résultats Discussion Camille Hertzka, Ingrid Elbilia, Bénédicte Lamotte

Introduction Camille Hertzka

introduction - Liée à un polymorphisme génétique ??? - VKORC1 - Variabilité interindividuelle dans la réponse à un médicament : la warfarine - Liée à un polymorphisme génétique ??? - VKORC1

La Warfarine Anticoagulant oral : AVK Prescrite dans divers pathologies associées à un risque de thrombose Grande variabilité interindividuelle : - hypersensibilité ( hémorragie ) - résistance (thrombose)  Index thérapeutique étroit

Facteurs de variabilités dans la réponse à la warfarine Facteurs environnementaux: régime alimentaire… Facteurs génétiques Dose de warfarine Age, poids, début de traitement,durée de traitement, indication thérapeutique, etc Interactions médicamenteuses

de l’activité catalytique CYP2C9 = enzyme principale dans le métabolisme de la warfarine Il existe plusieurs variants alléliques: - CYP2C9*1 - CYP2C9*2 - CYP2C9*3  Avec ces 2 allèles : des concentrations plasmatiques de warfarine de l’activité catalytique

VKORC1 (sous unité 1 de la vitamine K époxyde réductase) Identification du gène en 2004 Rats résistants à la warfarine… Elle régénère la vitamine K pour permettre la synthèse de facteurs de coagulation. - VKOR = cible de la warfarine

Facteurs inactifs II, VII, IX et X Facteurs actifs II, VII, IX et X WARFARINE VKOR ( vitamine K époxyde réductase) Vitamine K réduite époxide Carboxylase Facteurs inactifs II, VII, IX et X Facteurs actifs II, VII, IX et X

objectifs Identifier les polymorphismes de VKORC1 Établir un lien entre ces polymorphismes génétiques et la dose de warfarine Expliquer le mécanisme par lequel ces polymorphismes influenceraient la dose de warfarine

PATIENTS, MATERIELS, ET METHODES Ingrid Elbilia

1 - La sélection 2 - Le suivi LES PATIENTS 1 - La sélection 2 - Le suivi

1 - La sélection Patients Caucasiens, sous traitement anticoagulant oral: WARFARINE sélectionnés à partir d’une précédente étude (menée entre mai 1995 et avril 1999) ayant pour objectif d’étudier l’influence du polymorphisme du gène CYP2C9 sur la dose moyenne journalière de WARFARINE (DMJ).Ces patients souffraient de thrombose et venait alors débutait un traitement anticoagulant, à l’Hôpital de Naples. Comparaison avec une population témoin : individus apparemment sains, tiré au hasard (sélection randomisée) au sein de l’hôpital de Naples (entre 1995 et 1999).

2 - Le suivi Visite régulière > mesure du taux d’INR > adaptation de dose de Warfarine (W) ou pas ? INR = reflet de la fluidité sanguine Valeur d’INR attendue pour une correcte anticoagulation : 2 < INR < 3 Si INR < 2 alors le sang n’est pas assez fluide Augmente dose de W Si INR > 3 alors risque hémorragique Diminue dose de W Patients ont un Carnet où il note chaque jour : la dose de W prise Complication hémorragique? Changement du régime alimentaire? Association avec d’autres drogues? Maladie? Intervention chirurgicale (qui nécessite une absence d’ AVK)?

La Période d’étude clinique Début du traitement Anticoagulant: la WARFARINE Prise de sang pour extraction d’ADN: Analyse par PCR du polymorphisme CYP2C9

MATERIELS & METHODES 1- Extraction d’ADN et analyse. 2 - Analyse d’ARN. 3- Analyses statistiques.

1- Extraction d’ADN et analyse. Reprise de l’ADN des populations (patient et témoin), étudiées pour le polymorphisme du gène CYP2C9 (entre 1995 et 1999) pour étude en 2004 du gène VKORC1. A l’époque : Prise de sang, extraction d’ADN des leucocytes de la circulation périphérique (amplification du gène CYP2C9). Stockage de l’ADN restant. PCR, du gène VKORC1,utilisant des sondes sens et anti-sens à partir base de donnée des séquences connues du gène. (amplification de l’ADN codant la protéine VKORC1). SEQUENCAGE (analyse du polymorphisme).

2 - Analyse d’ARN. Étude du polymorphisme (1173 C>T) de l’ARNm du gène VKORC1. 2 constructions d’ARNm : 1173 1173 AAA AAA 5’ 3’ 5’ 3’ T C PCR et SEQUENCAGE (VERIF pas de mutations induites). PURIFIACTION des produits de PCR (gel agarose 1%) CLONAGE au sein d’ADN plasmidique eucaryote purifié. Clones positifs (ADNp ayant intégré l’ARNm: 5’ 3’ ) sont séquences TRANSFECTION dans Cellules HELA (pour augmenter la quantité d’ARNm) PURIFICATION des ARNm RT-PCR (fabrication d’ADNc du gène VKORC1, portant soit l’allèle C ou l’allèle T).

DMJ 3- Analyses statistique Fréquence allélique Haplotype Génotype Comptage des gènes Génotype VKORC1 Haplotype CYP2C9 Influence de VKOR et haplotype sur la DMJ: Modèle de régression linéaire multiple ajusté pour A) et B) ANOVA (2 facteurs) ajusté pour A) et B). ? DMJ Comparaison multiple des différents haplotypes CYP2C9: ANOVA(1 facteur) sur données non appariées. SHEFFE TEST sur données appariées. Évaluation des différentes caractéristiques GENOTYPIQUES: Test U non paramétrique (M&W) (Var continue et discontinue) Test X2 (Var continue ) Alpha=5% A) B) Age au début du TAC Sexe Indication INR moyen Durée totale du TAC Nb visites Influence d’autres drogues sur différents modèles, ajustés pour le Nb total de drogues: Co-administrées OU Métabolisées seulement par CYP2C9

RESULTATS 1- Caractéristiques des patients et du TAC oral 2- Analyse au locus du gène VKORC1 3- Les haplotypes CYP2C9 4- L’effet du polymorphisme (1173 C>T) du gène VKORC1 sur le splicing d’ARNm

1- Caractéristiques des patients et du TAC oral Entre 1995 et 1999 : (ADN pour étude haplotype CYP2C9 sur DMJ) Sur 203 patients présents à la clinique : 199 étaient sous Warfarine 184 ont donné leur consentement pour l’étude. 37 pour qui Génotype non disponible. En 2004: (ADN pour étude polymorphisme VKORC1 sur DMJ) Ainsi il reste 147 patients Descriptif de ces patients et de la population témoin: Patients sous W: n=147, range:15-84 ans, mean: 43 ans Population témoin: n=77, range:31-73 ans, mean: 52.5 ans Il n’y a pas de différence significative (sexe, indication,durée moy du TAC, Dose moy de W, INR moy et nb de visite) entre les 147 patients inclus pour l’étude et les 52 patients sous W non étudiés.

2- Analyse au locus du gène VKORC1 Description de VARIANTS GENETIQUE : 2 mutations faux-sens : HTZ; (112G>T) ; position 38 (ADN); exon1; Protéine : ASP TYR HTZ; (3556 G>A); position 151 (ADN); exon3; Protéine : ARG GLN 2 mutations silencieuses : (ADN) : position 129 / retrouvé chez 1 individu / (Proteine): CYS 43 3462 / 1 / LEU 120 2 Polymorphismes : (ADN): position 1173 / Transition (C > T) / dans l’intron 1 3730 / (G > A) / en 3’ UTR 1 individu 1 individu

Table 2. Genetic characteristics of anticoagulated patients Polymorphism Allele N (%) Genotype N (%) VKORC1 1173C >T C 177 (60.2) CC 54 (36.8) T 117 (39.8) CT 69 (46.9) TT 24 (16.3) 3730G >A G 192 (65.3) GG 67 (45.5) A 102 (34.7) GA 58 (39.5) AA 22 (15.0) CYP2C9 Arg144Cys Arg 244 (83.0) Arg/Arg 97 (66.0) Cys 50 (17.0) Arg/Cys 50 (34.0) Cys/Cys — Ile359Leu Ile 268 (91.2) Ile/Ile 122 (83.0) Leu 26 (8.8) Leu/Ile 24 (16.3) Leu/Leu 1 (0.7) CC 20 (26%) CT 45(58,4%) TT 12(15,6%) NS sujet sains

3- Les haplotypes CYP2C9 ARG/ARG ARG/CYS ILE/ILE 74 (haplo*1) Exon3 Exon 7 ARG/ARG ARG/CYS ILE/ILE 74 (haplo*1) 48 (haplo*3) 122 LEU/ILE 22 2 24 haplo*2 haplo*2+*3 LEU/LEU 1 1 TOT=147 97 50 - 48 patients portent 1CYS (144) dans l’exon 3, tous HTZ,et 1 ILE(359) dans l’exon 7(haplo*2). / 23 patients, 22HTZ et 1HMZ, qui portent 1 ARG(144)dans l’exon 3 et 1 ILE(359)exon7(haplo*3). /2 patients portent 1CYS (144) exon3 et 1LEU(359) exon7 (haplo*2*3).

Il n’a pas de différence significative entre les différents génotypes de VKORC1 , et les différents haplotypes de CYP2C9, selon sexe, indication, durée du TAC, INRmoyen, % prise autres M, et nb de visite.

? LEGENDE Mean age when OAT started, y Warfarin mean daily dose, mg   Mean age when OAT started, y Warfarin mean daily dose, mg       VKORC1                 1173C >T                 P < 0.001 Sheffe test SD   CC, n =54, 36..8%   7.0 (3.0)* 5.1 (2.5)*             ?   CT, n = 69, 46..9%                 P =0. 64 Sheffe test NS   TT, n = 24, 16..3%         3.7 (1.6)             3730G >A           *P .001 vs TT carriers, Sheffe test †P .05 vs AA carriers , M&W ‡P .05 vs CYP2C9*2 CYP2C9*3 carriers §P .05 vs CYP2C9*1 carriers, Sheffe test     LEGENDE       GG, n = 67, 45..5%                 5.2 (2.6)†   GA, n =58, 39..5%             P =0. 065 Sheffe test 5.3 (2.2)   AA, n =22, 15..0%                 NS 6.9 (4.0) CYP2C9                   Allele*1, n =74, 50..3%       6.6 (2.9) 5.1 (2.2)§         41.9 (15.3)‡   Allele*2, n = 48, 32..0%       P < 0.05 Sheffe test NS           44.5 (17.6)     Allele*3, n = 23, 16..3%               47.9 (16.7)   3.5 (1.9)§   Allele*2Allele*3, n = 2, 1.4%         1.8 (0.1)§         76.5 (9.2)

Grâce au modèle de régression linéaire multiple, on a pu ajuster les différentes variables (sexe, indication, durée du TAC, INR moy, autres drogues, nb de visite), et montrer que: - Le polymorphisme du gène VKORC1 (1173C>T) expliquerait 14% de la variance (r2 = 0.138, p<0.001). - Les variants des gènes de CYP2C9, expliqueraient quant à eux 21% de la variance (r2 = 0.215, p<0.001). Ainsi, au total, 30% de la variabilité inter-individuelle, sur la dose de Warfarine nécessaire, serait expliquée par le polymorphisme des ces 2 GENES (VKORC1 et CYP2C9). D’autre part il y’a un effet significatif de l’âge sur le début du TAC (r2 = 0.063; p<0.001). Et pour finir l’ANOVA, démontre qu’il n’y a pas d’interaction significative entre les différentes variables analysées (A). La dose de W nécessaire chez les patients porteurs de l’haplotype *1 du gène CYP2C9, ou du génotype (CC) du gène VKORC1, est significativement PLUS élevée que chez les autres variants génétiques; (Tableau4).

4 - L’effet du polymorphisme (1173 C>T) du gène VKORC1 sur le splicing de l’ARNm Ce polymorphisme affecte t-il l’épissage de l’ARNm du gène VKORC1 dans la mesure où un génotype CC « a besoin  de plus de W » qu’un génotype CT ou TT, est ce parce que la protéine VKOR est plus active? Ainsi ils ont transfécté des cellules Hela, avec une construction contenant l’allèle C ou T +(tous les exons et introns, + portions 5’UTR et 3’UTR.) ou rien (Contrôle). Les 2 allèles donnent respectivement une bande à 700pb, proche de celle attendue(676pb). Il semblerait alors que le polymorphisme (1173C>T) n’affecte pas l’épissage de l’ARNm du gène VKORC1.

DISCUSSION Bénédicte LAMOTTE

Identification des variants polymorphiques de VKORC1

Influence du gène VKORC1 sur la DMJ INTERET DES RESULTATS: découverte d ’un variant polymorphique du gène VKORC1 ayant un rôle potentiel dans la variabilité thérapeutique de la warfarine.

Rieder MJ et coll. N Engl J Med 2005 Identification de 10 variants polymorphiques du gène VKORC1(avec fréquence > 5%) les 5 + prédictifs: sont fortement corrélés à un autre variant par déséquilibre de liaison. expliquent 21 à 25% de la variabilité de la DMJ, soit environ 3 fois plus que le CYP2C9 (6 à 10%). 2 types d ’haplotypes: fréquence varie en fonction de l ’ethnie. probable mécanisme transcriptionnel.

Recherche pharmacogénétique avant initiation d ’un traitement par AVK? PERSPECTIVES Recherche pharmacogénétique avant initiation d ’un traitement par AVK?

IDENTIFICATION DES SUJETS A RISQUE Sujet âgé avec anomalies génétiques multiples (CYP 2C9, VKORC1) permet de prévenir les accidents hémorragiques à l ’initiation du traitement par: dose initiale de warfarine à 1 ou 1,5mg/j surveillance par INR plus rapprochée au début éventuellement alternative thérapeutique (Ximelagatran)

PREDICTION INDIVIDUALISEE DE DOSE Algorithme basé sur les variables: âge, sexe, race, surface corporelle traitement par amiodarone et/ou statine génotype CYP2C9 permet la prédiction de: 39% de la variabilité de la DMJ sur la population de construction Gage et al. Thromb Haemost 2004 42% de la variabilité de la DMJ en prospectif Voora et al. Thromb Haemost 2005

ETAPES A VENIR identification des facteurs de prédiction pharmacogénétiques prise en compte dans un nouvel algorithme validation du nouvel algorithme (études prospectives) essai clinique randomisé comparant 2 stratégies: pratique courante actuelle vs prédiction individualisée de dose par algorithme basé sur la pharmacogénétique SI RESULTATS POSITIFS: barrières logistiques: Génotypage de routine (rapidité, faisabilité) evaluation coût-efficacité

CONCLUSIONS

WARFARINE: une cible de choix pour une approche pharmacogénétique: grande variabilité interindividuelle prévalence d ’allèles pertinents index thérapeutique étroit  impact important en terme de santé publique avec: diminution du temps d ’équilibration du traitement diminution des contrôles d ’INR une régression des complications hémorragiques

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, Nickerson DA, Eby CS, McLeod HL, Blough DK, Thummel KE, Veenstra DL, Rettie AE. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose. N Engl J Med. 2005 Jun 2;352(22):2285-93. Gage BF, Eby C, Milligan PE, Banet GA, Duncan JR, McLeod HL. Use of pharmacogenetics and clinical factors to predict the maintenance dose of warfarin. Thromb Haemost. 2004 Jan;91(1):87-94. Voora D, Eby C, Linder MW, Milligan PE, Bukaveckas BL, McLeod HL, Maloney W, Clohisy J, Burnett RS, Grosso L, Gatchel SK, Gage BF. Prospective dosing of warfarin based on cytochrome P-450 2C9 genotype. Thromb Haemost. 2005 Apr;93(4):700-5. Hillman MA, Wilke RA, Yale SH, Vidaillet HJ, Caldwell MD, Glurich I, Berg RL, Schmelzer J, Burmester JK. A prospective, randomized pilot trial of model-based warfarin dose initiation using CYP2C9 genotype and clinical data. Clin Med Res. 2005 Aug;3(3):137-45.