Les phycocolloïdes Diane JOUANNEAU 19 juillet 2007

Les phycocolloïdes colloïde : matière sous forme de micro particules (2 à 200 nm) dispersées dans un liquide ou un gel. On parle d’hydrocolloïdes car ces biopolymères sont solubles dans l’eau Phycocolloïdes : - alginates - agars, carraghénanes  Autres molécules d’intérêt extraites des macroalgues - immunostimulants des végétaux iode, oxylipines Principaux colloïdes extraits des algues = polysaccharides Autres polysaccharides d’intérêt industriel: cellulose, amidon, pectines

Petits rappels sur la nomenclature des sucres Carbone 1: α ou ß (liaison glycosidique) Carbones asymétriques: permettent de différencier les différents monosaccharides Liaison C5-C6: isomères optique D ou L (hexose) (Chaise, cycle pyranique)

Les principaux monosaccharides constitutifs des polysaccharides de la paroi des végétaux oxydation 4C1 agar, carraghénane alginate oxydation oxydation alginate 1C4

Schéma simplifié de la paroi des algues brunes 1. Squelette polysaccharidique Cellulose Xylofucoglucanes (hémicellulose) 2. Matrice polysaccharidique Alginates et/ou acides uroniques Fucanes 3. Réseaux de protéines et autres constituants Oses neutres (galactose) Protéines ou peptides Polyphénols ou acides aminés aromatiques Ions, H2O Estelle Deniaud Polysaccharides pariétaux des algues brunes 15 à 40 % du poids sec, 35 à 45 % du poids sec chez les laminaires

Quelques rappels de rhéologie Solution visqueuse : solution qui possède des propriétés de résistance à la déformation (cisaillement, écoulement, …) supérieure à celle du solvant pur. Gel : solution dans lequel le solvant est emprisonné dans un réseau 3D et ne peut se déplacer librement. Les propriétés mécaniques du gel (dureté, élasticité,…) dépendent de la structure de ce réseau macromoléculaire. Hystérésis : lors d’un changement d’état, le seuil énergétique est différent selon le sens de la transition (sol –gel ou gel-sol par exemple) Synérèse : lors de la formation du gel, de l’eau est expulsée de la masse Thixotropie : sous action mécanique, le gel se désorganise, sa viscosité diminue au cours du temps. Au repos, le gel se réorganise et la viscosité retrouve sa valeur initiale

Les alginates : Historique et généralités - Les premières expériences scientifiques sur l’extraction des alginates à partir d’algues brunes ont été réalisées par le chimiste anglais E. C. Stanford à la fin du 19ième siècle. - Début de la production industrielle d’alginates aux USA dans les années 1930. l’alginate est un des biopolymères les plus « polyvalents » et est utilisé dans l’agro-alimentaire et l’industrie pharmaceutique/domaine médical car il possède de nombreuses propriétés: épaississant, stabilisant, gélifiant, formation de biofilm. polymère (linéaire) de structure hétérogène, composé de motifs beta-D-mannuronate et alpha-L-guluronate

MGGGGGGMMMMMMMMGMGMGMGMMMMMM Structure des alginates des algues brunes O H HO C OH O H C HO ManA GulA polyanion O H C OH OH GulA GulA ManA ManA GulA ManA MGGGGGGMMMMMMMMGMGMGMGMMMMMM G-block M-block MG-block M-block  2 types de monomères, 3 types de bloc

MGGGGGGMMMMMMMMGMGMGMGMMMMMM Mise en évidence des différents blocs d’alginates: spectrométrie RMN du proton M-1 G-5M G-5G G-1 GG-5G M-1M M-1G MG-5M MG-5G GG-5M 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 4.3 Chemical shift (ppm) MGGGGGGMMMMMMMMGMGMGMGMMMMMM G-block M-block MG-block M-block

Mécanisme d’action d’une Mannuronane C5-épimérase Voie de synthèse de l’alginate chez les algues brunes Mécanisme d’action d’une Mannuronane C5-épimérase COO- C5-épimérase O O COO- R' R' OH HO OH HO R-O R-O b -D-Mannuronate a -L-Guluronate M G Les activités sont connues, mais les gènes correspondant n’ont pas été isolés, sauf pour les C5-épimérases.

O H C M M M M C-5 Epimerase O H C M G M M L'épimérisation induit un changement de conformation

Espèces récoltées pour l’extraction d’alginate Algues brunes trouvées sur les côtes rocheuses - Atlantique Nord: récolte aux USA, au Canada, en France, en Angleterre et en Norvège Europe et USA : récolte dans les populations naturelles - Pacifique: Chine, Japon, Amérique du Sud algues cultivées  aquaculture

Algues brunes utilisées pour la production d’alginate Phaeophyta Phaeophyceae Laminariales kelps Fucales wracks Laminariaceae Alariaceae Lessoniaceae Fucaceae Laminaria Ecklonia Lessonia Macrocystis Ascophyllum Fucus L. hyperborea L. digitata A. nodosum F. serratus L. nigrescens L. trabeculata E. maxima M. pyrifera

Variation de la composition en alginates La composition en alginate dépend: - de l’espèce d’algue brune de la nature des tissus: - pied: quantité élevée de blocs G - lame: quantité élevée de blocs M - de l’âge des tissus de la zone de croissance des lieux de récolte (M/G plus petit dans les modes battus) - de la saison M/G variable selon les espèces récoltées : Macrocystis pyrifera M/G = 1.6 Laminaria hyperborea M/G = 0.45 Laminaria digitata M/G = 1.2 Ascophyllum nodosum M/G = 1.6 Fucus serratus M/G = 1.0

Mécanisme de gélification des alginates: le modèle “boîtes à oeufs” polyanion MMMMMMM MGMGMGMG GGGGGGGG Ca2+ Ca2+ Pelotes Ca2+ Agrégation des chaînes Dimérisation des chaînes

Vers l’alginate de son choix … Structure de l’alginate  Fonctionnalité technologique  Si alginate riche en: Blocs M, blocs MG: les alginates sont peu rigides, flexibles (exemple pour les parties soumises à l’action des vagues) - Blocs G: gel très résistant en présence de Ca2+ (ou autres ions divalents), donc augmentation de la rigidité (et bon ancrage de l’algue à son support)  Biotechnologie ? Mannose  Résidu M  Résidu G Oxydation C5 épimérase Alginate M/G élevé  M/G faible Visqueux Gel

Mode de gélification à froid en présence de sels Les alginates : Propriétés rhéologiques Mode de gélification à froid en présence de sels Acide alginique (gel souple, rétention d’eau)  Alginate de sodium (solution visqueuse) Alginate de calcium (gel dur, exclusion de l’eau, thermostable) Viscosité:  viscosité si  longueur de la chaîne alginate  température d’un degré   viscosité de 2,5% Si liaisons calcium-alginate très fortes, pas de dénaturation du gel par la chaleur Ions monovalents Ions divalents Affinité variable Mg < Ca < Sr < Ba pH < 3.5 : précipitation alginate Boîte à œufs des gels calciques

Les alginates : procédés de production Principe : - acide alginique et sels correspondant insolubles - alginates de sodium ou de potassium solubles Étapes de production réactifs utilisés produits obtenus Algues brunes  Broyage et déminéralisation Lixiviation Broyage et extraction alcaline Filtration Précipitation Lavages/centrifugation Neutralisation Séchage et broyage Formol 5%, acide dilué H2SO4 0,2N puis H2O Na2CO3 4 % HCl Sels alcalins de Na ou K Acide alginique Alginate de sodium Alginate de Na ou K Poudre

Les alginates : applications - Agents de texture polyvalents - Épaississants (contrôle de la viscosité) - Gélifiants - Stabilisants (notamment par rapport à la chaleur) - Réducteurs de cristaux (produits surgelés) - Protecteurs (films alimentaires) - Différents gels selon les sels Gels calciques Durs, thermostables, insolubles Peu coûteux, non toxiques Gels acides souples Instables à la chaleur Substituts potentiels de la gélatine (concentration inférieure)

Les alginates : applications anciennes, actuelles et en devenir dans différents types d’industrie - Industrie agro-alimentaire - Cosmétique, pharmacie, médecine - Autres industries : textile, papier, traitement des eaux

Alginates: considérés comme additifs alimentaires Additif alimentaire: Substance ajoutée intentionnellement aux denrées alimentaires pour remplir certaines fonctions technologiques Liste positive émise par la communauté européenne : Nécessité technologique Ne trompe pas le consommateur Sans danger pour le consommateur 5 grandes catégories : E100-199 : colorants alimentaires E200-299 : conservateurs E300-399 : anti-oxygène E400-495 : agents de texture : gélifiants, épaississants, émulsifiants, stabilisants E500-1505 : édulcorants, acidifiants, exhausteurs de goût, arômes Naturels, semi-naturels ou synthétiques E 400 Acide alginique E 401 Alginate de sodium E 402 Alginate de potassium E 403 Alginate d'ammonium E 404 Alginate de calcium E 405 Alginate de propane-1,2-diol

Les alginates : applications en industrie agro-alimentaire  Glaces, crèmes glacées, sorbets: - contrôle de la formation de cristaux (au moment de la congélation) - révélateur de goûts - texture fine, onctueuse et unie  bonne sensation en bouche  Nappage pâtissier: gelée de fruits  tartes et tartelettes aux fruits Entremets et desserts: fromages frais, crèmes fouettées, mousses parfumées, crèmes pâtissières, gâteaux de riz, …  Stabilisateurs des émulsions de type huile-eau: assaisonnements et sauces (ketchup, mayonnaise, vinaigrette, …)  Produits restructurés: à base de fruits, légumes, viandes et poisson (facile à manipuler  mise en forme du produit final) divers: - clarification des huiles, du vin, du vinaigre, de la bière - lubrification des boyaux de charcuterie - enrobage du poisson congelé - stabilisation de produits liquides (jus de fruits, lait, …)  Nourriture pour animaux (pour donner la forme des croquettes)

Les alginates : autres applications industrielles Textile: alginates inertes par rapports aux colorants et aux fibres, utilisés pour l’impression (fixation des colorants et contrôle de leur migration) Papier: traitement de surface des papiers (coloration, glaçage, couchage des papiers de luxe)  Traitements des eaux de surface: élimination des matières en suspension (coloration, turbidité) Enrobage des bâtons de soudure (protection du fil de métal contre l’oxydation) Autres: incorporation dans le latex, les peintures, les plâtres de moulure, les céramiques, les colles, les résines, les mines de crayon, certains produits horticoles, certaines bombes aérosols…

Les alginates : applications en cosmétique, pharmacie, médecine Pharmacie/Cosmétique: masques (soins du visage), pâtes dentifrices, empreintes dentaires sirops, lotions, pommades (traitement brûlures et blessures), compresses, pansements, Médecine: biomatériaux, implants immunoisolés, drug delivery system

Les billes d’alginates - Agents d’enrobage pour molécules actives, micro-organismes - Taille adaptable, perméable aux molécules

Pigmented calcium alginate beads Hydrogel beads with pigments and colors that can add a special eye-appeal to your product. We offer a variety of pigments, including pearlescent pigments, fluorescent pigments, metallic pigments or interference pigments. Alginate beads with encapsulated powders Hydrogel beads of various materials for incorporating high loadings of organic or inorganic powders, e.g. mineral powders, metal oxids, or amino acids. The beads can be used in wet of dried state. Alginate beads with oil Various oils can be incorporated into alginate beads at loadings of 5...30 %. These oils may also be or contain fragrances or flavors. The beads might coated and dried also. Alginate beads for food application Beads of various natural polymers incorporating flavours or colorants to be added to food products.

Agars et carraghénanes : Historique et généralités Agar-agar est un mot d’origine malaise qui désigne la gelée obtenue à partir de diverses algues rouges: gélidium, gracilaria... et dont la découverte s’est faite accidentellement au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Carraghénane – carragin : gaélique irlandais : petit rocher Mousse qui se ramasse sur les rochers. Varec’h en breton, lichen de mer Les gens utilisaient cette «mousse» pour leurs pommades et leurs flans. L’utilisation des agar et des carraghénanes en tant que stabilisateur, épaississant et gélifiant s’est accrue avec l’expansion de l’industrie alimentaire.

Les polysaccharides pariétaux des algues rouges β(1-4) α(1-3) Agarose α(1-3) β(1-4) k-carraghénane Densité de charges négatives n α(1-3) β(1-4) i-carraghénane n α(1-3) β(1-4) l-carraghénane n

Modalités de gélification Gels iono- et thermo-réversibles Pelote statistique Hélices Agrégation des hélices, formation du gel Variables Température [carraghénane] [sel] Nature du sel

Les algues rouges agarophytes Agars : Polysaccharides pariétaux des agarophytes Gracilaires : nombreux genres selon les régions Gelidium serrulatum Gracilaria sp. Qualité des agars variable - selon les espèces - selon la saison

Exploitation Gracilaria (Amérique du Sud, Afrique, Asie) 37000 tPS Gelidium (Maroc, Espagne, Portugal) 18600 tPS Agar 6400 tPS = marché mondial 132 millions $ Récolte Gracilaires (Asie du Sud-Est)

Les agars : structure chimique Polymère de Galactose a(1-3) b(1-4) Unité de base agarobiose agarose = polymère constitué uniquement d'unités agarobiose agaropectine = polymère constitué d'unités agarobiose substituées (groupements méthyles, sulfates, pyruvates…) Agar = agarose + agaropectine La qualité de l'agar dépend de la proportion d'agaropectine

Les agars : propriétés rhéologiques Gélification modulable en faisant varier la température Agar en poudre Agar en solution Gel d'agar Dissolution à chaud Refroidissement Caractéristiques uniques des gels d’agars : - Force de gel élevée - Les plus résistants du marché - Gélification spontanée sans additifs - Thermoréversibilité et thermostabilité - Stable (pH, micro-organismes, attaques enzymatiques, cations) - Gonflement et rétention d’eau - Piégeage de composés hydrophobes

Les agars : applications 90 % en alimentaire E406 : gélifiant Inodore, incolore, sans saveur Produits laitiers : flans Pâtisseries : glaçages, nappages Confiserie : bonbons Produits à tartiner : substitution des pectines pour réduire le taux de sucre Produits carnés : substitution de la matière grasse Gélifiants mais aussi intérêt diététique : faible apport calorique (0.6 kcal/g)

Les agars : applications 10 % en biotechnologie : agar bactériologique Milieu de culture bactériologique par excellence

Utilisations actuelles Agar Alimentaire Gelidium, Gracilaria, Pterocladia, Gelidiella, Ahnfeltia Pharmacologique Gelidium Bactériologique Gelidium, Pterocladia Pur Gelidium

Les carraghénanes Historique – Exploitation - Sources Polysaccharides pariétaux des carraghénophytes Variables selon les espèces, selon le développement En Asie et en Afrique Kappaphycus alvarezii Fermes de cultures Problèmes de maladies En Europe et au Canada Chondrus crispus Populations naturelles ou cultures 50000 tonnes d’algues récoltées par an au Canada

Les carraghénanes : structure chimique Polymère de galactose β(1-4) α(1-3) Unité de base carrabiose Galactanes sulfatés (15 à 40 % de sulfates) Trois principaux types idéaux et leurs précurseurs Multitude de motifs hybrides

Les carraghénanes : structure chimique Origine Gelification Viscosité α(1-3) β(1-4) Chondrus Gigartina Eucheuma cotonii Kappa Fort Faible n β(1-4) α(1-3) Iota Eucheuma spinosum Faible Fort n α(1-3) β(1-4) Lambda Gigartina Néant Très élevée n

Les carraghénanes : procédé de production Carraghénophytes  Broyage Traitement thermique Filtration Ultrafiltration Précipitation Séchage et broyage CaCl2 2 % Elimination des impuretés NaOH 0.1N 90-95 °C Extraction, maturation Terre d’infusoires Elimination des impuretés Isopropanol Poudre Notion de carraghénane semi-raffiné PES : Processed Euchema Seaweed = E407

Les carraghénanes : propriétés rhéologiques Exemple du k-carraghénane : gels iono- et thermo-réversibles Mode de gélification à chaud, renforcé par les sels k-carraghénane en poudre Dissolution à chaud Solution visqueuse ou gel élastique lors du refroidissement Gel rigide en présence de sels

Les carraghénanes : propriétés rhéologiques Pelote Hélices Hélices agrégées Différents gels selon les sels et selon les types de carraghénanes Gel de Kappa Gel de Iota

Utilisations actuelles Composé Effet Application Lait chocolaté Glaces et crèmes dessert Conserve de viande Nourriture pour animaux Gels désodorisants d’atmosphère Immobilisation d’enzymes Cultures in vitro k-carraghénane gélifiant Desserts Sauces Glaces et crèmes glacées Cosmétiques i-carraghénane gélifiant Desserts Sauces Dentifrice Cosmétique l-carraghénane épaississant E 407 Carraghénanes E 407a Algues Euchema transformées

L’avenir des phycocolloïdes Des utilisations actuelles …vers de nouvelles utilisations Choix de nouvelles sources : - Prospection : choix de nouveaux stocks/ressources MAIS : contrainte de respect des populations stocks Modifications : Voies chimiques : hémi-synthèse, greffages - Voies enzymatiques Maîtrise de la taille et de la pureté des polysaccharides Maîtrise de la nature des polysaccharides Origine naturelle des enzymes : algues, mollusques marins, bactéries marines Génie génétique : clonage, surexpression dans bactéries ou levures

Modification de la taille Glycoside hydrolase (GH) : coupure des liaisons osidiques  GH - Agarase, - Iotase, Lambdase, Kappase - Alginate lyase Différents mécanismes de coupure: Exo : en bout de chaîne Endo-aléatoire : en milieu de chaîne Processif : le long sur la chaîne

Modes d’action des polysaccharidases Exo = Attaque l’extrémité de la chaîne Un produit d’hydrolyse Topologie poche (ex: glucoamylase) Endo = Attaque aléatoire Topologie sillon (ex: amylase) Produit statistique

Modes d’action des polysaccharidases Processivité Après une première attaque alétatoire, l’enzyme glisse le long de la chaîne avant d’effectuer une seconde attaque Topologie en tunnel (ex: cellobiohydrolase) Essentiellement des produits de faibles poids moléculaires

Conversion/maturation Nu  Iota Mu  Kappa (Soluble) (Gel) Sulfatases et sulfurylases : conversion m n k i

Commentaires ? Questions ?

Travaux pratiques Toucher les polysaccharides préparés dans différentes conditions Alginates de 3 algues brunes à des concentrations différentes (0,5 et 2%) : Laminaria digitata Laminaria hyperborea Macrocystis pyrifera Carraghénanes : 3 types à des concentrations différentes (0,5 et 2%) : Iota i Lambda l Kappa k

Influence des sels sur la texture 4 phycocolloïdes : - Alginate 1% (L. digitata) - Iota-carraghénane 1% - Lambda-carraghénane 1% - Kappa-carraghénane 1% 4 ions : 2 cations monovalents : NaCl 5% KCl 5% 2 cations divalents : CaCl2 5% MgCl2 5%

Récapitulatif Laminaria digitata Laminaria hyperborea Macrocystis pyrifera 0.5% Alginate 2% Polysaccharides i l k 0.5% Carraghénane 2% Alginate 1% (L. d.) NaCl KCl CaCl2 MgCl2 Sels i l k Carraghénane 1% Lait (caséine + lactose) Carraghénane 1% k Lait écrémé 5%

Tableau de texture Alginates Carraghénanes Agar Chaud : Froid : Laminaria digitata Laminaria hyperborea Macrocystis pyrifera 0.5% 2% Alginates Laminaria digitata NaCl KCl CaCl2 MgCl2 1% Carraghénanes Kappa Iota Lambda 0.5% 2% NaCl KCl CaCl2 MgCl2 Lait écrémé 1% Agar Chaud : Froid :