Loss-of-Function Mutations of the Rice GAMYB Gene Impair Fiorucci Anne-Sophie Simon Marianne Loss-of-Function Mutations of the Rice GAMYB Gene Impair α-amylase Expression in Aleurone and Flower Development Kaneko et al., janvier 2004

Plan de l’exposé Introduction I- Manipulations et résultats Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. Problématique. I- Manipulations et résultats Sélection de mutants OsGAMYB KO. Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase. Phénotypage des mutants. Profil d’expression du gène OsGAMYB. II- Discussion Contradictions avec d’autres articles. Critiques Conclusion

Exemple du caryopse d’Orge Introduction : Rôle de l’acide gibbérellique (GA) lors de la germination Albumen AMIDON Tégument + péricarpe α-amylase Couche à aleurone Glucides simples GA Scutellum Exemple du caryopse d’Orge Embryon

Introduction : Mode d’action de l’acide gibbérellique dans la graine. Synthèse dans l’embryon Migration jusqu’à la couche à aleurone GA Activateur transcriptionnel dans les cellules de la couche à aleurone GAMYB Induit l’expression de l’α-amylase GAMYB est un régulateur positif de la voie de signalisation médiée par l’acide gibbérellique (cas de l’orge)

Introduction : Problématique développée Rôle de GAMYB bien connu dans les caryopses d’Orge Quelles sont ses fonctions hors de la couche à aleurone ? Protéine étudiée : OsGAMYB, homologue de GAMYB chez le riz Objectifs : par l’observation de mutants, étude du rôle de OsGAMYB au cours de la croissance végétative lors du développement floral

Plan de l’exposé Introduction I- Manipulations et résultats Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. Problématique. I- Manipulations et résultats Sélection de mutants OsGAMYB KO. Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase. Phénotypage des mutants. Profil d’expression du gène OsGAMYB. II- Discussion Contradictions avec d’autres articles. Critiques Conclusion

I-1) Sélection de mutants OsGAMYB KO A noter : le riz ne possède qu’un seul gène GAMYB Méthode utilisation de lignées dont les mutations sont causées par l’insertion d’un rétrotransposon, Tos17 criblage par PCR avec des amorces spécifiques du gène et du transposon confirmation de l’insertion de Tos17 dans le gène d’intérêt et de sa transmission à la descendance

Vérification : Complémentation avec le sauvage Objectif : confirmer que les phénotypes anormaux observés chez le mutant sont dus à l’inactivation de GAMYB Méthode : introduction du gène OsGAMYB sauvage chez les mutants (utilisation d’un vecteur plasmidique) Résultat : les plantules retrouvent le phénotype sauvage. Le phénotype mutant caractérisé est bien causé par l’inactivation de GAMYB

I-2) Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase. a- 1ère expérience Agarose + amidon La présence d’amidon est révélée par du lugol. GA (1µM) Graine sans embryon issue des lignées mutantes gamyb-2 S’il y a production d’α-amylase, l’amidon sera hydrolysé. D’où l’apparition de zones claires sur la boîte.

Graines issues de la lignée mutante Résultats obtenus : Graines issues de la lignée mutante seules 75% des graines présentent un halo clair, preuve de la sécrétion d’ α-amylase les autres sont homozygotes pour l’allèle mutant Témoin : graines sauvages zones claires autour de toutes les graines activité α-amylasique normale

b- 2ème expérience : RNA gel blot analysis [GA]=10-6 M suffit à induire l’expression de l’α-amylase dans les cellules de la couche à aleurone Pas d’induction de l’expression de l’α-amylase avec ou sans GA Les allèles contenant l’insertion Tos17 ont perdu la fonction OsGAMYB.

I- 3) Phénotypage des mutants. a- Au stade végétatif. 2 semaines 8 semaines après germination Aucune différence n’est observée. développement post germination identique, plants mutants et sauvages indiscernables. une même réponse au GA après la germination. Élongation des feuilles en fonction de la concentration en GA exogène. WT gamyb1

b- Lors du développement floral Phase transition (transition du SAM en méristème floral) et passage d’un stade à l’autre à des époques similaires, en jours courts comme en jours longs. => osGAMYB non essentiel à la phase transition ni au développement du méristème inflorescentiel. Heading time différent. => Contribution partielle à la formation du méristème floral. élongation des entrenoeuds normale mais longueur finale du 1er entrenoeud inférieure à celle du sauvage. Peut-être la cause du délai de heading time. WT mutant

Observation des organes floraux :  Phénotype mild, le plus courant : - étamines aux anthères rétrécies, sans pollen (plantes « mâle stériles »). Cause cellulaire de cette stérilité : problème au niveau du tapis staminal, les microspores ne s’y attachent pas, se rétrécissent -> les cellules du tapis envahissent toute l’anthère. - pas de problème au niveau des autres organes, pistil fertile notamment. carpelle étamine sauvage mutant phénotype mild Coupes longitudinales de fleurs de riz anthère filet WT mutants Étamines de fleurs de riz  Certains phénotypes plus sévères (pistil stérile), selon conditions environnementales, et non selon mutant.

I- 4) Profil d’expression du gène OsGAMYB. But : vérifier que OsGAMYB est exprimé de manière spécifique dans les tissus ou cellules montrant des phénotypes anormaux dans les plants mutants. a- couplage avec la protéine Gus. Principe : ADN plasmidique Promoteur de OsGAMYB ORF codant la protéine Gus Transfection dans un cal de riz WT via Agrobacterium tumefaciens. L’activité β-glucuronidase de GUS peut être détectée in-situ (coloration bleue).

Coupe longitudinale d’une graine de riz, après 24h de réhydratation. Observation dans une graine en germination. Couche à aleurone de l’endosperme Tégument de l’embryon 2mm Coupe longitudinale d’une graine de riz, après 24h de réhydratation. recouvre le patron d’expression de l’α-amylase.

Observation dans la jeune plantule 2mm Tissus vasculaires Couche épithéliale Coupe longitudinale d’une plantule de 2 semaines. Aucune expression dans les autres tissus et organes de la plantule.

Observation dans un plant au stade végétatif. Racine de riz 1mm Coupe longitudinale d’un plant de 2 mois 2mm Expression de Gus à l’extrémité des racines uniquement. Aucune expression dans les organes aériens au stade végétatif.

Coupe longitudinale d’une tige au stade d’élongation. Observation dans un plant au stade d’élongation. SAM Départs de racines adventives Coupe longitudinale d’une tige au stade d’élongation. 1cm Forte expression dans la région apicale dont SAM et primordia foliaires. Expression modérée dans la zone d’élongation de l’entrenoeud et les départs de racines.

Observation dans les organes floraux. Très forte expression dans les primordia d’organes floraux. Organes précis dans lesquels a lieu l’expression non déterminés. Pour ce faire, utilisation d’une autre technique : L’hybridation in situ.

Cellule exprimant OsGAMYB b- Hybridation in situ. Principe : Sonde : brin antisens de l’extrémité 3’-term de l’ADNc de OsGAMYB, marquée par du digoxigenin-UTP (étiquette fixée par transcription in vitro). Organe fixé et déshydraté Sondes Témoin avec une sonde brin sens : pas de signal d’hybridation, on a bien fixation sur l’ARNm et non sur un éventuel ADN dénaturé. 5’ 3’ 3’ ARNm 5’ Cellule exprimant OsGAMYB

Confirmation d’une donnée de Gus. Primordia de feuilles Méristème apical végétatif d’un plant de 2 mois. SAM Primordium de bractée Méristème apical à la transition florale. Pas d’hybridation de la sonde donc d’expression dans la zone apicale au stade végétatif. Observation d’un léger signal d’hybridation dans le SAM et les primordia au stade transition florale.

Observation dans les organes floraux. Primordium d’étamine Méristème floral en développement. 0,1mm 25µm Épiderme Endothélium Couche intermédiaire Tapis staminal Cellule mère des microspores Section d’une anthère en développement. Fort signal dans les primordia d’étamines, modéré dans les primordia des autres organes floraux. - Après différentiation anthère / filament: expression dans les cellules du tapis staminal, jamais dans les cellules mères des microspores. Remarque : résultats en accords avec ceux observés chez l’Orge.

Confirmation d’un rôle de OsGAMYB dans ces cellules ou organes. c- Bilan. Expression de OsGAMYB spécifiquement dans les organes et cellules présentant un phénotype différent du sauvage dans les mutants KO : Dans les cellules exprimant l’α-amylase. Dans les entrenoeuds en élongation. Dans les méristèmes apicaux au moment de la transition florale. Dans les étamines et plus précisément dans les cellules du tapis staminal. Donc : Confirmation d’un rôle de OsGAMYB dans ces cellules ou organes.

Plan de l’exposé Introduction I- Manipulations et résultats Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. Problématique. I- Manipulations et résultats Sélection de mutants OsGAMYB KO. Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase. Phénotypage des mutants. Profil d’expression du gène OsGAMYB. II- Discussion Contradictions avec d’autres articles. Critiques Conclusion

II-1) contradictions avec des articles précédents. Blàzquez et al (1998): Timing de la floraison d’A thaliana régulé par le gène LEAFY. Blàzquez and Weigel (2000): Présence d’un GAMYB Binding Domain dans les séquences cis de LEAFY, nécessaire à son expression normale. D’où modèle proposé par Gocal et al (2001): GA + GAMYB LEAFY Floraison En contradiction avec l’absence de rôle dans le timing de la floraison ici observée chez le riz. Une différence entre les deux espèces ou…?

II-2) Analyse critique Démarche classique de génétique inverse Point positif de l’article : multiplication des démarches pour vérifier que les phénotypes mutants observés sont bien le résultat de l’inactivation de OsGAMYB. Ce qui manque peut-être : étude quantitative de l’expression de OsGAMYB (Southern Blot) faire un lien entre l’expression du gène OsGAMYB dans les différents organes et le GA réalisation d’une autre expérience avec la protéine Gus, avec ajout de GA, et d’un Southern Blot avec ajout de GA exogène.

Conclusion : Rôle de OsGAMYB D’autres mutants du riz insensibles au GA présentent des défauts de croissance des feuilles et des racines => rôle de GA. Mais : signalisation du GA indépendante de OsGAMYB au stade végétatif. Rôle significatif de GAMYB, non dans la transition florale, mais plus tard, pour le développement du méristème inflorescentiel.

Rôle dans la mise en place des organes floraux : modèle proposé. Rôle essentiel pour la méiose des cellules mères des microspores, donc pour la formation du pollen. Rôle indirect (Cf. profil d’expression), via cellules du tapis staminal. Modèle: Intervention de GAMYB OsGAMYB KO Tapis staminal 1- adhésion 2- contraction du cytoplasme – 1ere division Pas d’adhésion Cellule mère des microspores => Pas de méiose, dégénérescence de la cellule mère. Mutants KO pour GA : développement du pollen bloqué avant ou après la méiose de la cellule mère. => On peut supposer une intervention conjointe de GA et OsGAMYB dans ce mécanisme.